Bezwzględna masa molowa - Absolute molar mass

Zanotuj różne masy czarno-białe i wright. A także instrumenty użyte do jego defektu?

Historia

Pierwsze bezwzględne pomiary mas cząsteczkowych (tj. dokonywane bez odniesienia do wzorców) opierały się na podstawowych cechach fizycznych i ich związku z masą molową. Najbardziej przydatne z nich to osmometria membranowa i sedymentacja .

Inne absolutnie instrumentalne podejście było również możliwe dzięki opracowaniu teorii rozpraszania światła przez Alberta Einsteina , Chandrasekharę Venkatę Ramana , Petera Debye'a , Bruno H. Zimma i innych. Problem z pomiarami wykonanymi za pomocą osmometrii membranowej i sedymentacji polegał na tym, że charakteryzowały one jedynie właściwości masy próbki polimeru . Ponadto pomiary były zbyt czasochłonne i podatne na błędy operatora . W celu uzyskania informacji o polidyspersyjnej mieszaninie mas molowych opracowano metodę rozdzielania różnych rozmiarów. Osiągnięto to dzięki pojawieniu się chromatografii wykluczania (SEC). SEC opiera się na fakcie, że pory w materiale wypełnienia kolumn chromatograficznych mogą być na tyle małe, aby cząsteczki mogły tymczasowo utknąć w ich przestrzeniach śródmiąższowych. Gdy próbka przechodzi przez kolumnę, mniejsze cząsteczki spędzają więcej czasu podróżując w tych pustych przestrzeniach niż te większe, które mają mniej miejsc do „wędrowania”. W rezultacie próbka jest rozdzielana według jej objętości hydrodynamicznej . W konsekwencji w eluencie pojawiają się najpierw duże cząsteczki, a następnie małe. Wybierając odpowiedni materiał wypełnienia kolumny, można określić rozdzielczość systemu. Kolumny można również łączyć w szeregi, aby zwiększyć rozdzielczość lub zakres badanych rozmiarów. ${\ Displaystyle V_ {h}}$

Następnym krokiem jest przeliczenie czasu, w którym próbki uległy elucji, na pomiar masy molowej. Jest to możliwe, ponieważ gdyby znana była masa molowa wzorca, to czas, w którym wzorzec został wymyty, powinien być równy określonej masie molowej. Korzystając z wielu standardów, można opracować krzywą kalibracji czasu w funkcji masy molowej. Jest to istotne w przypadku analizy polimerów, ponieważ można wykazać, że pojedynczy polimer zawiera wiele różnych składników, a ich złożoność i rozkład wpłynęłyby również na właściwości fizyczne. Jednak ta technika ma wady. Na przykład, nieznane próbki są zawsze mierzone w odniesieniu do znanych standardów, a standardy te mogą, ale nie muszą mieć podobieństwa do próbki będącej przedmiotem zainteresowania. Pomiary wykonane przez SEC są następnie matematycznie przekształcane na dane podobne do tych znalezionych za pomocą istniejących technik.

Problem polegał na tym, że system został skalibrowany zgodnie z charakterystyką Vh wzorców polimerowych, które nie są bezpośrednio związane z masą molową. Jeżeli zależność między masą molową a Vh wzorca nie jest taka sama jak w przypadku nieznanej próbki, kalibracja jest nieważna. Zatem, aby być dokładnym, kalibracja musi wykorzystywać ten sam polimer, o tej samej konformacji, w tym samym eluencie i mieć taką samą interakcję z rozpuszczalnikiem, gdy warstwa hydratacyjna zmienia Vh.

Benoit i in. wykazali, że uwzględnienie objętości hydrodynamicznej rozwiąże problem. W swojej publikacji Benoit wykazał, że wszystkie syntetyczne polimery eluują się na tej samej krzywej, gdy logarytm lepkości istotnej pomnożony przez masę molową wykreślono w funkcji objętości elucji. Jest to podstawa uniwersalnej kalibracji, która wymaga wiskozymetru do pomiaru lepkości istotnej polimerów. Wykazano, że uniwersalna kalibracja działa w przypadku polimerów rozgałęzionych, kopolimerów oraz polimerów typu starburst.

Aby uzyskać dobrą chromatografię, nie może występować żadna interakcja z kolumną poza tą produkowaną przez rozmiar. Wraz ze wzrostem wymagań dotyczących właściwości polimerów wzrosła również konieczność uzyskania bezwzględnych informacji o masie molowej i rozmiarze. Było to szczególnie ważne w zastosowaniach farmaceutycznych, gdzie niewielkie zmiany masy molowej (np. agregacja ) lub kształtu mogą skutkować różną aktywnością biologiczną . Zmiany te mogą w rzeczywistości mieć szkodliwy wpływ, a nie korzystny.

Aby uzyskać masę molową, przyrządy do rozpraszania światła muszą mierzyć intensywność światła rozproszonego pod kątem zerowym. Jest to niepraktyczne, ponieważ źródło lasera przewyższałoby intensywność rozpraszania światła pod kątem zerowym. Dwie alternatywy to pomiar kąta bardzo bliskiego zeru lub pomiar pod wieloma kątami i ekstrapolacja za pomocą modelu (Rayleigh, Rayleigh-Gans-Debye, Berry, Mie, itp.) do kąta zerowego.

Tradycyjne przyrządy do rozpraszania światła działały na podstawie odczytów pod różnymi kątami, z których każdy był mierzony szeregowo. Na początku lat 70. opracowano system rozpraszania światła pod niskim kątem, który umożliwił wykorzystanie pojedynczego pomiaru do obliczenia masy molowej. Chociaż pomiary pod małymi kątami są lepsze z fundamentalnych powodów fizycznych (cząsteczki mają tendencję do rozpraszania większej ilości światła w kierunkach pod mniejszymi kątami niż pod większymi kątami), zdarzenia rozpraszania pod małymi kątami spowodowane kurzem i zanieczyszczeniem fazy ruchomej łatwo przytłaczają rozpraszanie z cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania . Kiedy w latach 70. i połowie lat 80. popularne stało się rozpraszanie światła laserowego pod niskim kątem (LALLS), dobrej jakości filtry jednorazowe nie były łatwo dostępne, a zatem pomiary wielokątowe zyskały na popularności.

Wielokątowe rozpraszanie światła zostało wynalezione w połowie lat 80. i tego rodzaju instrumenty były w stanie wykonywać pomiary pod różnymi kątami jednocześnie, ale dopiero w późnych latach 80. (10-12) połączenie wielokątowego rozpraszania światła laserowego ( detektory MALS) do systemów SEC były praktyczną propozycją umożliwiającą określenie zarówno masy molowej, jak i wielkości z każdego kawałka frakcji polimeru.

Aplikacje

Pomiary rozpraszania światła można zastosować do syntetycznych polimerów , białek , farmaceutyków i cząstek, takich jak liposomy , micele i białka w kapsułkach. Pomiary mogą być wykonywane w jednym z dwóch trybów, które są niefrakcjonowane (tryb okresowy) lub w trybie ciągłym (z SEC, HPLC lub dowolną inną metodą frakcjonowania przepływowego ). Eksperymenty w trybie wsadowym mogą być wykonywane przez wstrzyknięcie próbki do celi przepływowej za pomocą strzykawki lub przy użyciu oddzielnych fiolek. Pomiary te są najczęściej używane do pomiaru zdarzeń w czasie, takich jak reakcje przeciwciało-antygen lub składanie białek . Pomiary w trybie wsadowym można również wykorzystać do określenia drugiego współczynnika wirusowego (A2), wartości, która stanowi miarę prawdopodobieństwa krystalizacji lub agregacji w danym rozpuszczalniku. Eksperymenty z przepływem ciągłym można wykorzystać do badania materiału eluującego z praktycznie dowolnego źródła. Bardziej konwencjonalnie, detektory są sprzężone z różnymi systemami separacji chromatograficznej. Możliwość określenia masy i rozmiaru wymywanego materiału łączy zatem zalety systemu separacji z bezwzględnym pomiarem masy i rozmiaru wymywanego materiału.

Dodanie detektora SLS sprzężonego z systemem chromatograficznym pozwala na wykorzystanie SEC lub podobnego rozdziału w połączeniu z korzyścią bezwzględnej metody detekcji. Dane dotyczące rozpraszania światła zależą wyłącznie od sygnału rozpraszania światła razy stężenia; czas elucji nie ma znaczenia, a rozdział można zmienić dla różnych próbek bez ponownej kalibracji. Ponadto można również zastosować metodę rozdzielania bez wielkości, taką jak HPLC lub IC. Ponieważ detektor rozpraszania światła jest zależny od masy, staje się bardziej czuły wraz ze wzrostem masy molowej. Jest więc doskonałym narzędziem do wykrywania agregacji. Im wyższy numer agregacji, tym bardziej czuły staje się detektor.

Metoda niskokątowego (laserowego) rozpraszania światła (LALS)

Pomiary LALS mierzą pod bardzo małym kątem, gdzie wektor rozpraszania jest prawie zerowy. LALS nie wymaga żadnego modelu, aby dopasować zależność kątową, dzięki czemu zapewnia bardziej wiarygodne pomiary mas cząsteczkowych dla dużych cząsteczek. Sam LALS nie daje żadnego wskazania na pierwiastek średniego promienia kwadratowego.

Metoda wielokątowego (laserowego) rozpraszania światła (MALS)

Pomiary MALS działają poprzez obliczenie ilości światła rozproszonego pod każdym wykrytym kątem. Obliczenia opierają się na zmierzonej intensywności światła i wydajności kwantowej każdego detektora. Następnie wykorzystuje się model do przybliżenia natężenia światła rozproszonego pod kątem zerowym. Światło rozproszone pod kątem zerowym jest następnie powiązane z masą molową.

Jak wcześniej zauważono, detektor MALS może również dostarczać informacji o wielkości cząsteczki. Ta informacja to promień pierwiastka kwadratowego cząsteczki (RMS lub Rg). Różni się to od wspomnianego powyżej Rh, który bierze pod uwagę warstwę nawilżenia. Czysto matematyczny pierwiastek średniokwadratowy jest zdefiniowany jako promienie tworzące cząsteczkę pomnożone przez masę przy tym promieniu.

Bibliografia

• A. Einsteina , Ann. Fiz. 33 (1910), 1275
• CV Raman, Indian J. Phys. 2 (1927), 1
• P. Debye, J. Appl. Fiz. 15 (1944), 338
• BH Zimm, J. Chem. Fiz. 13 (1945), 141
• BH Zimm, J. Chem. Fiz. 16 (1948), 1093
• BH Zimm, RS Stein i P. Dotty, Pol. Byk. 1, (1945), 90
• M. Fixman, J. Chem. Fiz. 23 (1955), 2074
• AC Ouano i W. Kaye J. Poly. Nauka. A1(12) (1974), 1151
• Z. Grubisic, P. Rempp i H. Benoit, J. Polym. Nauka, 5 (1967), 753
• Przepływ przez detektor MALS, DLS 800, Science Spectrum Inc.
• PJ Wyatt, C. Jackson i GK Wyatt Am. Laboratorium 20(6) (1988), 86
• PJ Wyatt, DL Hicks, C. Jackson i GK Wyatt Am. Laboratorium. 20(6) (1988), 106
• C. Jackson, LM Nilsson i PJ Wyatt J. Appl. Poli. Nauka. 43 (1989), 99