Przesiewanie o wysokiej przepustowości — High-throughput screening

Wysokowydajne roboty przesiewowe

Badania przesiewowe o wysokiej przepustowości ( HTS ) to metoda eksperymentów naukowych stosowana szczególnie w odkrywaniu leków i mająca znaczenie w dziedzinie biologii i chemii . Wykorzystując robotykę , oprogramowanie do przetwarzania/kontroli danych, urządzenia do obsługi cieczy i czułe detektory, wysokoprzepustowe badania przesiewowe pozwalają naukowcom na szybkie przeprowadzenie milionów testów chemicznych, genetycznych lub farmakologicznych. Dzięki temu procesowi można szybko zidentyfikować aktywne związki, przeciwciała lub geny, które modulują określony szlak biomolekularny. Wyniki tych eksperymentów dostarczają punktów wyjścia do projektowania leków i zrozumienia braku interakcji lub roli określonej lokalizacji.

Przygotowanie płytki testowej

Ramię robota obsługuje płytkę testową

Kluczowym sprzętem laboratoryjnym lub naczyniem testowym HTS jest płytka do mikromiareczkowania : mały pojemnik, zwykle jednorazowy i wykonany z tworzywa sztucznego, który zawiera siatkę małych, otwartych wgłębień zwanych studzienkami . Ogólnie, mikropłytki do HTS mają 96, 192, 384, 1536, 3456 lub 6144 studzienki. Są to wszystkie wielokrotności 96, odzwierciedlające oryginalną 96-dołkową mikropłytkę z odsuniętymi dołkami 8 x 12 z 9 mm odstępem. Większość dołków zawiera elementy testowe, w zależności od charakteru eksperymentu. Mogą to być różne związki chemiczne rozpuszczone np w wodnym roztworze w dimetylosulfotlenku (DMSO). Studzienki mogą również zawierać komórki lub enzymy pewnego typu. (Pozostałe dołki mogą być puste lub zawierać czysty rozpuszczalnik lub niepoddane obróbce próbki, przeznaczone do użycia jako kontrole eksperymentalne .)

Placówka badań przesiewowych zazwyczaj posiada bibliotekę płyt podstawowych , których zawartość jest starannie skatalogowana, a każda z nich mogła zostać stworzona przez laboratorium lub uzyskana ze źródła komercyjnego. Same płytki podstawowe nie są bezpośrednio używane w eksperymentach; zamiast tego w razie potrzeby tworzone są oddzielne płytki testowe . Płytka testowa jest po prostu kopią płytki podstawowej, utworzoną przez pipetowanie niewielkiej ilości płynu (często mierzonej w nanolitrach ) z dołków płytki podstawowej do odpowiednich dołków całkowicie pustej płytki.

Obserwacja reakcji

Aby przygotować się do testu , badacz wypełnia każdą studzienkę płytki jakąś jednostką biologiczną, na której chce przeprowadzić eksperyment, taką jak białko , komórki lub zarodek zwierzęcy . Po upływie pewnego czasu inkubacji umożliwiającego materiałowi biologicznemu wchłonięcie, związanie lub inną reakcję (lub brak reakcji) ze związkami w dołkach, we wszystkich dołkach płytki wykonuje się pomiary, ręcznie lub maszynowo. Pomiary ręczne są często niezbędne, gdy badacz używa mikroskopii do (na przykład) poszukiwania zmian lub wad rozwoju embrionalnego spowodowanych przez związki zawarte w studniach, szukając efektów, których komputer nie jest w stanie samodzielnie określić. W przeciwnym razie specjalistyczna zautomatyzowana maszyna analityczna może przeprowadzić szereg eksperymentów na studzienkach (takich jak świecenie na nie spolaryzowanym światłem i pomiar współczynnika odbicia, który może wskazywać na wiązanie białek). W takim przypadku maszyna wyprowadza wynik każdego eksperymentu w postaci siatki wartości liczbowych, przy czym każda liczba jest mapowana na wartość uzyskaną z jednego dołka. Maszyna analityczna o dużej pojemności może zmierzyć dziesiątki płytek w ciągu kilku minut, bardzo szybko generując tysiące eksperymentalnych punktów danych.

W zależności od wyników tego pierwszego testu, badacz może wykonać kolejne testy na tym samym ekranie, „zbierając” płyn ze studzienek źródłowych, który dał interesujące wyniki (znane jako „trafienia”) na nowe płytki testowe, a następnie ponownie uruchamiając eksperyment, aby zebrać dalsze dane na temat tego zawężonego zbioru, potwierdzając i udoskonalając obserwacje.

Systemy automatyki

System karuzeli do przechowywania płytek testowych o dużej pojemności i szybkim dostępie

Automatyzacja jest ważnym elementem użyteczności HTS. Zazwyczaj zintegrowany system robota składający się z jednego lub więcej robotów transportuje mikropłytki testowe ze stanowiska do stanowiska w celu dodania próbki i odczynnika, mieszania, inkubacji i wreszcie odczytu lub wykrywania. System HTS może zwykle przygotowywać, inkubować i analizować wiele płytek jednocześnie, co dodatkowo przyspiesza proces zbierania danych. Obecnie istnieją roboty HTS, które mogą testować do 100 000 związków dziennie. Automatyczne zbieracze kolonii zbierają tysiące kolonii drobnoustrojów do wysokowydajnych badań genetycznych. Termin uHTS lub ultra-wysokiej przepustowości odnosi się (około 2008 r.) do badania przesiewowego ponad 100 000 związków dziennie.

Projektowanie eksperymentów i analiza danych

Dzięki możliwości szybkiego badania przesiewowego różnych związków (takich jak małe cząsteczki lub siRNA ) w celu identyfikacji aktywnych związków, HTS doprowadziło do eksplozji szybkości danych generowanych w ostatnich latach. W konsekwencji, jednym z najbardziej fundamentalnych wyzwań w eksperymentach HTS jest zebranie znaczenia biochemicznego z nagromadzonych danych, które opierają się na opracowaniu i przyjęciu odpowiednich projektów eksperymentalnych i metod analitycznych zarówno do kontroli jakości, jak i selekcji trafień. Badania HTS to jedna z dziedzin, których cecha została opisana przez Johna Blume'a, Chief Science Officer for Applied Proteomics, Inc. w następujący sposób: Wkrótce, jeśli naukowiec nie zrozumie niektórych statystyk lub podstawowych technologii przetwarzania danych, może nie będzie uważany za prawdziwego biologa molekularnego, a tym samym stanie się po prostu „dinozaurem”.

Kontrola jakości

Wysokiej jakości testy HTS mają kluczowe znaczenie w eksperymentach HTS. Opracowanie wysokiej jakości testów HTS wymaga integracji zarówno eksperymentalnych, jak i obliczeniowych podejść do kontroli jakości (QC). Trzy ważne sposoby kontroli jakości to (i) dobry projekt płytki, (ii) wybór skutecznych dodatnich i ujemnych kontroli chemicznych/biologicznych oraz (iii) opracowanie skutecznych metryk QC do pomiaru stopnia zróżnicowania, tak aby testy z gorszymi danymi jakość można zidentyfikować. Dobry projekt płytki pomaga zidentyfikować błędy systematyczne (zwłaszcza te związane z pozycją dołka) i określić, jaką normalizację należy zastosować, aby usunąć/zredukować wpływ błędów systematycznych zarówno na QC, jak i wybór trafień.

Skuteczne metody analitycznej kontroli jakości służą jako strażnik doskonałej jakości testów. W typowym eksperymencie HTS wyraźne rozróżnienie między kontrolą pozytywną a negatywną referencją, taką jak kontrola negatywna, jest wskaźnikiem dobrej jakości. Zaproponowano wiele metod oceny jakości w celu pomiaru stopnia zróżnicowania między kontrolą pozytywną a negatywną referencją. Do oceny jakości danych przyjęto stosunek sygnału do tła, stosunek sygnału do szumu, okno sygnału, stosunek zmienności testu i współczynnik Z. Ostatnio zaproponowano ściśle standaryzowaną średnią różnicę ( SSMD ) do oceny jakości danych w testach HTS.

Wybór trafień

Związek o pożądanej wielkości efektów w HTS nazywany jest hitem. Proces wyboru trafień nazywa się selekcją trafień. Metody analityczne selekcji trafień na ekranach bez powtórzeń (zwykle na ekranach podstawowych) różnią się od tych z powtórzeniami (zwykle na ekranach potwierdzających). Na przykład metoda z-score jest odpowiednia dla przesiewów bez powtórzeń, podczas gdy statystyka t jest odpowiednia dla przesiewów z powtórzeniami. Obliczanie SSMD dla ekranów bez replikacji również różni się od tego dla ekranów z replikami.

W przypadku selekcji trafień w przesiewach pierwotnych bez powtórzeń, łatwo interpretowalne wartości to średnia krotność zmiany, średnia różnica, procent hamowania i procent aktywności. Jednak nie wychwytują one skutecznie zmienności danych. Metoda z-score lub SSMD, która może rejestrować zmienność danych w oparciu o założenie, że każdy związek ma taką samą zmienność jak negatywne odniesienie na ekranach. Jednak wartości odstające są powszechne w eksperymentach HTS, a metody takie jak z-score są wrażliwe na wartości odstające i mogą być problematyczne. W konsekwencji do selekcji trafień zaproponowano i przyjęto metody odporne, takie jak metoda z*-score, SSMD*, metoda B-score i metoda oparta na kwantylu.

Na ekranie z powtórzeniami możemy bezpośrednio oszacować zmienność dla każdego związku; w konsekwencji powinniśmy używać SSMD lub statystyki t, która nie opiera się na silnym założeniu, na którym opierają się wyniki z-score i z*-score. Jednym z problemów związanych ze stosowaniem statystyki t i powiązanych wartości p jest to, że ma na nie wpływ zarówno wielkość próby, jak i wielkość efektu. Pochodzą z testów na brak średniej różnicy, a zatem nie są przeznaczone do pomiaru wielkości efektów złożonych. Przy selekcji trafień głównym zainteresowaniem jest wielkość efektu w badanym związku. SSMD bezpośrednio ocenia wielkość efektów. Wykazano również, że SSMD jest lepsze niż inne powszechnie stosowane rozmiary efektów. Wartość populacji SSMD jest porównywalna we wszystkich eksperymentach, a zatem możemy użyć tego samego punktu odcięcia dla wartości populacji SSMD do pomiaru wielkości efektów złożonych .

Techniki zwiększające przepustowość i wydajność

Unikalne rozkłady związków na jednej lub wielu płytkach można wykorzystać albo w celu zwiększenia liczby oznaczeń na płytkę, albo w celu zmniejszenia zmienności wyników oznaczeń, lub obu. Upraszczającym założeniem przyjętym w tym podejściu jest to, że jakiekolwiek związki N w tej samej studzience zazwyczaj nie będą oddziaływać ze sobą lub z celem testu w sposób, który zasadniczo zmienia zdolność testu do wykrywania prawdziwych trafień.

Na przykład wyobraź sobie płytkę, na której związek A znajduje się w dołkach 1-2-3, związek B znajduje się w dołkach 2-3-4, a związek C znajduje się w dołkach 3-4-5. W teście tej płytki przeciwko danemu celowi trafienie w studzienkach 2, 3 i 4 wskazywałoby, że związek B jest najbardziej prawdopodobnym środkiem, zapewniając jednocześnie trzy pomiary skuteczności związku B przeciwko określonemu celowi. Komercyjne zastosowania tego podejścia obejmują kombinacje, w których żadne dwa związki nigdy nie mają więcej niż jednej studzienki, w celu zmniejszenia (drugiego rzędu) możliwości interferencji pomiędzy parami badanych związków.

Najnowsze postępy

Automatyzacja i formaty testów niskoobjętościowych zostały wykorzystane przez naukowców z NIH Chemical Genomics Center (NCGC) do opracowania ilościowego HTS (qHTS), paradygmatu profilowania farmakologicznego dużych bibliotek chemicznych poprzez generowanie pełnych zależności stężenie-odpowiedź dla każdego związku. Wraz z towarzyszącym oprogramowaniem dopasowującym krzywą i oprogramowaniem cheminformatycznym dane qHTS dają połowę maksymalnego stężenia efektywnego (EC50), maksymalną odpowiedź, współczynnik Hilla (nH) dla całej biblioteki umożliwiającej ocenę powstających zależności aktywności struktury (SAR).

W marcu 2010 roku opublikowano badanie demonstrujące proces HTS umożliwiający 1000 razy szybsze badanie przesiewowe (100 milionów reakcji w ciągu 10 godzin) przy jednomilionowych kosztach (przy użyciu 10-7- krotności objętości odczynnika) niż konwencjonalne techniki wykorzystujące mikroprzepływy oparte na kroplach. Krople płynu oddzielone olejem zastępują studzienki mikropłytek i umożliwiają analizę i sortowanie trafień podczas przepływu odczynników przez kanały.

W 2010 roku naukowcy opracowali krzemowy arkusz soczewek, który można umieścić na matrycach mikroprzepływowych, aby umożliwić pomiar fluorescencji 64 różnych kanałów wyjściowych jednocześnie za pomocą jednej kamery. Ten proces może analizować 200 000 kropli na sekundę.

W 2013 roku naukowcy ujawnili podejście wykorzystujące małe cząsteczki z roślin. Ogólnie rzecz biorąc, niezbędne jest zapewnienie wysokiej jakości walidacji słuszności koncepcji na wczesnym etapie procesu odkrywania leku. W tym przypadku kluczowe znaczenie mają technologie umożliwiające identyfikację silnych, selektywnych i biodostępnych sond chemicznych, nawet jeśli powstałe związki wymagają dalszej optymalizacji w celu opracowania produktu farmaceutycznego. Receptor jądrowy RORα, białko, które od ponad dekady jest celem identyfikacji silnych i biodostępnych agonistów, zostało wykorzystane jako przykład bardzo wymagającego celu dla leków. Trafienia są potwierdzane na etapie badań przesiewowych ze względu na krzywą w kształcie dzwonu. Ta metoda jest bardzo podobna do ilościowej metody HTS (jednoczesne badanie przesiewowe i potwierdzenie trafienia), z wyjątkiem tego, że zastosowanie tego podejścia znacznie zmniejsza liczbę punktów danych i może z łatwością przeszukiwać ponad 100 000 związków istotnych biologicznie.

Podczas gdy tradycyjne odkrycie leku HTS wykorzystuje oczyszczone białka lub nienaruszone komórki, bardzo interesujący niedawny rozwój technologii wiąże się z wykorzystaniem nienaruszonych żywych organizmów, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans i danio pręgowany ( Danio rerio ).

W latach 2016-2018 producenci płytek rozpoczęli produkcję specjalistycznej chemii, aby umożliwić masową produkcję powierzchni odstraszających komórki o bardzo niskiej przyczepności, co ułatwiło szybki rozwój testów podatnych na HTS w celu rozwiązania problemu odkrywania leków przeciwnowotworowych w tkankach 3D, takich jak organoidy i sferoidy; bardziej odpowiedni fizjologicznie format.

Zwiększenie wykorzystania HTS w środowisku akademickim do badań biomedycznych

HTS to stosunkowo nowa innowacja, możliwa do zrealizowania w dużej mierze dzięki nowoczesnym postępom w robotyce i szybkiej technologii komputerowej. Wciąż potrzeba wysoce wyspecjalizowanego i drogiego laboratorium badań przesiewowych do prowadzenia operacji HTS, więc w wielu przypadkach mała lub średniej wielkości instytucja badawcza będzie korzystać z usług istniejącego obiektu HTS, zamiast tworzyć go dla siebie.

W środowisku akademickim istnieje tendencja, by uniwersytety były własnymi przedsiębiorstwami zajmującymi się odkrywaniem leków. Te obiekty, które zwykle znajdują się tylko w przemyśle, coraz częściej znajdują się również na uniwersytetach. UCLA , na przykład, oferuje otwarte laboratorium HTS Molecular Screening Shared Resources (MSSR, UCLA), które może rutynowo przeszukiwać ponad 100 000 związków dziennie. Polityka otwartego dostępu zapewnia naukowcom z całego świata możliwość korzystania z tej możliwości bez długich negocjacji dotyczących własności intelektualnej. Z biblioteką związków ponad 200 000 małych cząsteczek, MSSR ma jedną z największych talii związków ze wszystkich uniwersytetów na zachodnim wybrzeżu. Ponadto MSSR oferuje pełne możliwości genomiki funkcjonalnej (siRNA całego genomu, shRNA, cDNA i CRISPR), które są komplementarne do wysiłków na rzecz małych cząsteczek: Genomika funkcjonalna wykorzystuje możliwości HTS do wykonywania badań obejmujących cały genom, które badają funkcję każdego genu w kontekście zainteresowania przez wybicie każdego genu lub jego nadekspresję. Równoległy dostęp do wysokoprzepustowego ekranu małych cząsteczek i ekranu całego genomu umożliwia naukowcom identyfikację i walidację celu dla danej choroby lub określenie sposobu działania na małej cząsteczce. Najdokładniejsze wyniki można uzyskać stosując „ułożone” funkcjonalne biblioteki genomiczne, tj. każda biblioteka zawiera pojedynczy konstrukt, taki jak pojedynczy siRNA lub cDNA. Genomika funkcjonalna jest zazwyczaj połączona z badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości przy użyciu np. mikroskopii epifluorescencyjnej lub laserowej cytometrii skaningowej.

University of Illinois ma również placówkę dla HTS, podobnie jak University of Minnesota. W Instytucie Nauk Przyrodniczych na Uniwersytecie Michigan mieści się placówka HTS w Centrum Genomiki Chemicznej. Columbia University posiada wspólny ośrodek zasobów HTS z około 300 000 różnych małych cząsteczek i około 10 000 znanych związków bioaktywnych dostępnych do badań przesiewowych biochemicznych, komórkowych i NGS. Rockefeller University posiada otwarte centrum zasobów HTS Resource Center HTSRC (The Rockefeller University, HTSRC ), które oferuje bibliotekę ponad 380 000 związków. Laboratorium Analizy Wysokowydajnej Northwestern University wspiera identyfikację celów, walidację, opracowywanie testów i badania przesiewowe związków. Non-profit Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute posiada również długoletni ośrodek HTS w Conrad Prebys Center for Chemical Genomics, który był częścią MLPCN. Non-profit Scripps Research Molecular Screening Center (SRMSC) nadal służy naukowcom w instytutach po ery MLPCN. Placówka SRMSC uHTS utrzymuje jedną z największych kolekcji bibliotek w środowisku akademickim, obecnie w ponad 665 000 jednostek małych cząsteczek i rutynowo przeszukuje pełną kolekcję lub podbiblioteki w celu wsparcia inicjatyw z wieloma grantami PI.

W Stanach Zjednoczonych National Institutes of Health lub NIH utworzyły ogólnokrajowe konsorcjum ośrodków badań przesiewowych małych cząsteczek w celu produkcji innowacyjnych narzędzi chemicznych do wykorzystania w badaniach biologicznych. Sieć Molecular Libraries Probe Production Centers Network (MLPCN) przeprowadza HTS na podstawie testów dostarczonych przez społeczność naukową, w odniesieniu do dużej biblioteki małych cząsteczek utrzymywanej w centralnym repozytorium cząsteczek.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki