Chromatografia jonowa - Ion chromatography

Nowoczesny system chromatografii jonowej

Chromatografia jonowymienna
Akronim IC, IEC
Klasyfikacja Chromatografia
Inne techniki
Związane z Wysokosprawna chromatografia cieczowa Chromatografia
wodna w normalnych fazach Chromatografia z
wykluczeniem wielkości
micelarna chromatografia cieczowa

Chromatografia jonowa (lub jonowymienna chromatografia ) rozdziela jony i molekuły polarne, w oparciu o ich powinowactwo do jonów wymieniacza. Działa na prawie każdy rodzaj naładowanej cząsteczki — w tym na duże białka , małe nukleotydy i aminokwasy . Jednak chromatografia jonowa musi być wykonywana w warunkach oddalonych o jedną jednostkę od punktu izoelektrycznego białka.

Dwa rodzaje chromatografii jonowej to anionowymienna i kationowymienna. Chromatografia kationowymienna jest stosowana, gdy cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest naładowana dodatnio. Cząsteczka jest naładowana dodatnio, ponieważ pH do chromatografii jest mniejsze niż pI (a/k/a pH(I)). W tego typu chromatografii faza stacjonarna jest naładowana ujemnie, a cząsteczki naładowane dodatnio są ładowane w celu przyciągnięcia do niej. Chromatografia anionowymienna ma miejsce, gdy faza stacjonarna jest naładowana dodatnio, a ujemnie naładowane cząsteczki (co oznacza, że ​​pH w chromatografii jest większe niż pI) są ładowane w celu przyciągnięcia do niej. Jest często stosowany w oczyszczaniu białek, analizie wody i kontroli jakości. Rozpuszczalne w wodzie i naładowane cząsteczki, takie jak białka, aminokwasy i peptydy, wiążą się z ugrupowaniami, które są naładowane przeciwnie, tworząc wiązania jonowe z nierozpuszczalną fazą stacjonarną. Zrównoważona faza stacjonarna składa się z jonizowalnej grupy funkcyjnej, w której docelowe cząsteczki mieszaniny, które mają być oddzielone i oznaczone ilościowo, mogą wiązać się podczas przechodzenia przez kolumnę — kationowa faza stacjonarna służy do oddzielania anionów, a anionowa faza stacjonarna jest używana do oddzielania kationów. Chromatografia kationowymienna jest stosowana, gdy pożądanymi cząsteczkami do oddzielenia są kationy, a chromatografia anionowymienna jest stosowana do oddzielania anionów. Związane cząsteczki można następnie wymyć i zebrać stosując eluent, który zawiera aniony i kationy, przepuszczając przez kolumnę wyższe stężenie jonów lub zmieniając pH kolumny.

Jedną z głównych zalet stosowania chromatografii jonowej jest tylko jedno oddziaływanie podczas rozdzielania, w przeciwieństwie do innych technik rozdzielania; dlatego chromatografia jonowa może mieć wyższą tolerancję matrycy. Kolejną zaletą wymiany jonowej jest przewidywalność wzorców elucji (na podstawie obecności grupy podatnej na jonizację). Na przykład, gdy stosuje się chromatografię kationowymienną, kationy są eluowane jako ostatnie. Tymczasem ujemnie naładowane cząsteczki wyjdą jako pierwsze. Jednak przy wykonywaniu chromatografii jonowymiennej występują również wady, takie jak ciągła ewolucja za pomocą techniki, która prowadzi do niespójności między kolumnami. Głównym ograniczeniem tej techniki oczyszczania jest to, że ogranicza się ona do grupy podatnej na jonizację.

Historia

Chromatografia jonowymienna

Chromatografia jonowa rozwinęła się dzięki gromadzeniu wiedzy na przestrzeni wielu lat. Począwszy od 1947, Spedding i Powell stosowali chromatografię jonowymienną z wyparciem do separacji pierwiastków ziem rzadkich. Dodatkowo wykazali separację jonowymienną izotopów 14N i 15N w amoniaku. Na początku lat pięćdziesiątych Kraus i Nelson zademonstrowali zastosowanie wielu metod analitycznych dla jonów metali w zależności od ich oddzielenia ich kompleksów chlorkowych, fluorkowych, azotanowych lub siarczanowych za pomocą chromatografii anionowej. Automatyczne wykrywanie w linii było stopniowo wprowadzane od 1960 do 1980 roku, a także nowatorskie metody chromatograficzne do rozdzielania jonów metali. Przełomowa metoda Smalla, Stevensa i Baumana z Dow Chemical Co. doprowadziła do powstania nowoczesnej chromatografii jonowej. Aniony i kationy można teraz skutecznie oddzielać za pomocą systemu wykrywania tłumionego przewodnictwa. W 1979 roku Gjerde et al. W ślad za nim w 1980 roku była podobna metoda chromatografii kationowej.

W rezultacie na rynku układów scalonych rozpoczął się okres ekstremalnej konkurencji, z zwolennikami zarówno tłumionego, jak i nietłumionego wykrywania przewodnictwa. Konkurencja ta doprowadziła do szybkiego rozwoju nowych form i szybkiej ewolucji IC. Wyzwaniem, które należy przezwyciężyć w przyszłym rozwoju IC, jest przygotowanie wysoce wydajnych monolitycznych kolumn jonowymiennych, a pokonanie tego wyzwania miałoby ogromne znaczenie dla rozwoju IC.

Boom na chromatografię jonowymienną rozpoczął się przede wszystkim w latach 1935-1950 podczas II wojny światowej i to dzięki „ projektowi Manhattan ” aplikacje i układy scalone zostały znacznie rozszerzone. Chromatografia jonowa została pierwotnie wprowadzona przez dwóch angielskich badaczy, Sir Thompsona z rolnictwa i chemika JT Waya. Prace Thompsona i Waya obejmowały działanie rozpuszczalnych w wodzie soli nawozowych, siarczanu amonu i chlorku potasu. Te sole nie mogły być łatwo wydobywane z ziemi z powodu deszczu. Przeprowadzili metody jonowe do obróbki gliny solami, co spowodowało ekstrakcję amoniaku oprócz uwalniania wapnia. W latach pięćdziesiątych i sześćdziesiątych opracowano modele teoretyczne dla IC w celu dalszego zrozumienia i dopiero w latach siedemdziesiątych zastosowano detektory ciągłe, torując drogę do rozwoju od chromatografii niskociśnieniowej do wysokosprawnej. Dopiero w 1975 roku „chromatografia jonowa” została ustanowiona jako nazwa w odniesieniu do technik, a następnie była używana jako nazwa w celach marketingowych. Obecnie IC jest ważne dla badania systemów wodnych, takich jak woda pitna. Jest to popularna metoda analizy pierwiastków lub kompleksów anionowych, która pomaga rozwiązywać problemy istotne dla środowiska. Podobnie ma również wielkie zastosowanie w branży półprzewodników .

Ze względu na dużą liczbę dostępnych kolumn rozdzielających, systemów elucji i detektorów, chromatografia stała się główną metodą analizy jonów.

Kiedy ta technika została początkowo opracowana, była używana głównie do uzdatniania wody. Od 1935 r. chromatografia jonowymienna szybko przekształciła się w jedną z najsilniej lewarowanych technik, której zasady są często stosowane w większości dziedzin chemii, w tym w destylacji, adsorpcji i filtracji.

Zasada

Chromatogram jonowy przedstawiający rozdział anionów

Chromatografia jonowymienna rozdziela cząsteczki na podstawie ich odpowiednich grup naładowanych. Chromatografia jonowymienna zatrzymuje cząsteczki analitu na kolumnie na podstawie oddziaływań kulombowskich (jonowych). Matryca chromatografii jonowymiennej składa się z jonów naładowanych dodatnio i ujemnie. Zasadniczo molekuły podlegają oddziaływaniom elektrostatycznym o przeciwnych ładunkach na macierzy fazy stacjonarnej. Faza stacjonarna składa się z nieruchomej matrycy zawierającej naładowane jonizowalne grupy funkcyjne lub ligandy. Powierzchnia fazy stacjonarnej zawiera jonowe grupy funkcyjne (RX), które oddziałują z jonami analitu o przeciwnym ładunku. Aby osiągnąć elektroneutralność, te obojętne ładunki łączą się z wymiennymi przeciwjonami w roztworze. Cząsteczki ulegające jonizacji, które mają zostać oczyszczone, konkurują z tymi wymiennymi przeciwjonami o wiązanie z unieruchomionymi ładunkami na fazie stacjonarnej. Te jonizowalne cząsteczki są zatrzymywane lub eluowane na podstawie ich ładunku. Początkowo wypłukiwane są cząsteczki, które nie wiążą się lub nie wiążą się słabo z fazą stacjonarną. Do elucji cząsteczek wiążących się z fazą stacjonarną potrzebne są zmienione warunki. Stężenie wymiennych przeciwjonów, które konkurują z cząsteczkami o wiązanie, można zwiększyć lub zmienić pH. Zmiana pH wpływa na ładunek poszczególnych cząsteczek, a zatem zmienia wiązanie. Cząsteczki następnie zaczynają się wymywać w oparciu o zmiany w ich ładunku wynikające z korekt. Dalsze takie dostosowania można zastosować do uwolnienia białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo stężenie przeciwjonów można stopniowo zmieniać w celu oddzielenia zjonizowanych cząsteczek. Ten typ elucji nazywa się elucją gradientową. Z drugiej strony można zastosować elucję etapową, w której stężenie przeciwjonów zmienia się w jednym etapie. Ten typ chromatografii dzieli się dalej na chromatografię kationowymienną i chromatografię anionowymienną . Dodatnio naładowane cząsteczki wiążą się z żywicami kationowymiennymi, podczas gdy ujemnie naładowane cząsteczki wiążą się z żywicami anionowymiennymi. Związek jonowy składający się z form kationowych M+ i form anionowych B- może być zatrzymany w fazie stacjonarnej.

Chromatografia kationowymienna zachowuje dodatnio naładowane kationy, ponieważ faza stacjonarna wyświetla ujemnie naładowaną grupę funkcyjną:

Chromatografia anionowymienna zachowuje aniony przy użyciu dodatnio naładowanej grupy funkcyjnej:

Należy zauważyć, że siłę jonową C+ lub A- w fazie ruchomej można regulować, aby przesunąć pozycję równowagi, a tym samym czas retencji.

Chromatogram jonowy przedstawia typowy chromatogram uzyskany na kolumnie anionowymiennej.

Procedura

Zanim będzie można rozpocząć chromatografię jonowymienną, należy ją zrównoważyć. Faza stacjonarna musi być dostosowana do pewnych wymagań, które zależą od eksperymentu, z którym pracujesz. Po zrównoważeniu naładowane jony w fazie stacjonarnej zostaną przyłączone do przeciwnie naładowanych jonów wymiennych. Wymienne jony, takie jak Cl- lub Na+. Następnie należy wybrać bufor, z którym może się związać pożądane białko. Po zrównoważeniu kolumnę należy przemyć. Faza płukania pomoże wypłukać wszystkie zanieczyszczenia, które nie wiążą się z matrycą, podczas gdy białko będące przedmiotem zainteresowania pozostaje związane. Ten bufor do próbek musi mieć takie samo pH jak bufor używany do równoważenia, aby pomóc w wiązaniu pożądanych białek. Białka nienaładowane będą wymywane z kolumny z podobną prędkością buforu przepływającego przez kolumnę. Po załadowaniu próbki na kolumnę i przemyciu kolumny buforem w celu wymycia wszystkich niepożądanych białek, elucję przeprowadza się w celu wymycia pożądanych białek, które są związane z matrycą. Związane białka są wymywane przez zastosowanie gradientu liniowo rosnącego stężenia soli. Wraz ze wzrostem siły jonowej buforu, jony soli będą konkurować z pożądanymi białkami o wiązanie się z naładowanymi grupami na powierzchni podłoża. Spowoduje to elucję pożądanych białek z kolumny. Białka, które mają niski ładunek netto, będą eluowane jako pierwsze, gdy stężenie soli wzrośnie, powodując wzrost siły jonowej. Białka o wysokim ładunku netto będą wymagały większej siły jonowej, aby mogły zostać wymyte z kolumny. Możliwe jest przeprowadzenie chromatografii jonowymiennej w masie, na cienkich warstwach podłoża, takich jak płytki szklane lub plastikowe pokryte warstwą pożądanej fazy stacjonarnej lub w kolumnach chromatograficznych. Chromatografia cienkowarstwowa lub chromatografia kolumnowa mają podobieństwa, ponieważ działają w ramach tych samych zasad rządzących; następuje stała i częsta wymiana cząsteczek, ponieważ faza ruchoma przemieszcza się wzdłuż fazy stacjonarnej. Nie jest konieczne dodawanie próbki w minutowych objętościach, ponieważ wcześniej określone warunki dla kolumny wymiany zostały wybrane tak, aby zaistniała silna interakcja między fazą ruchomą i stacjonarną. Ponadto mechanizm procesu elucji spowoduje kompartmentalizację różnych cząsteczek w oparciu o ich odpowiednie właściwości chemiczne. Zjawisko to jest spowodowane wzrostem stężeń soli na szczycie kolumny lub w jego pobliżu, tym samym przemieszczając cząsteczki w tej pozycji, podczas gdy cząsteczki związane niżej są uwalniane później, gdy wyższe stężenie soli osiąga ten obszar. Te zasady są powodami, dla których chromatografia jonowymienna jest doskonałym kandydatem do początkowych etapów chromatografii w złożonej procedurze oczyszczania, ponieważ może szybko uzyskać małe objętości cząsteczek docelowych niezależnie od większej objętości wyjściowej.

Komora (po lewej) zawiera wysokie stężenie soli. Komora mieszania (po prawej) zawiera niskie stężenie soli. Stopniowe mieszanie powoduje powstawanie gradientu soli w miarę przemieszczania się soli od wysokich do niskich stężeń.

Stosunkowo proste urządzenia są często używane do nakładania przeciwjonów o rosnącym gradiencie na kolumnę chromatograficzną. Przeciwjony, takie jak miedź (II), są wybierane najczęściej do skutecznego oddzielania peptydów i aminokwasów poprzez tworzenie kompleksu.

Do stworzenia gradientu soli można użyć prostego urządzenia. Bufor elucyjny jest konsekwentnie wciągany z komory do komory mieszania, zmieniając w ten sposób jego stężenie buforu. Generalnie bufor umieszczony w komorze ma zwykle wysokie stężenie początkowe, podczas gdy bufor umieszczony w komorze mieszania ma zwykle niskie stężenie. Gdy bufor o wysokim stężeniu z lewej komory jest mieszany i wciągany do kolumny, stężenie buforu w mieszanej kolumnie stopniowo wzrasta. Zmiana kształtu komory mieszania, jak również bufora granicznego, pozwala na uzyskanie wklęsłych, liniowych lub wypukłych gradientów przeciwjonu.

W fazie stacjonarnej stosuje się wiele różnych mediów. Wśród najczęściej stosowanych unieruchomionych grup naładowanych są trimetyloaminoetyl (TAM), trietyloaminoetyl (TEAE), dietylo-2-hydroksypropyloaminoetyl (QAE), aminoetyl (AE), dietyloaminoetyl (DEAE), sulfo (S), sulfometyl (SM), sulfopropyl ( SP), karboksy (C) i karboksymetyl (CM).

Pomyślne upakowanie kolumny jest ważnym aspektem chromatografii jonowej. Stabilność i wydajność końcowej kolumny zależy od sposobu wypełnienia, użytego rozpuszczalnika oraz czynników wpływających na właściwości mechaniczne kolumny. W przeciwieństwie do wczesnych nieefektywnych metod pakowania na sucho, pakowanie na mokro w zawiesinie, w którym cząstki zawieszone w odpowiednim rozpuszczalniku są dostarczane do kolumny pod ciśnieniem, wykazuje znaczną poprawę. Do wykonywania pakowania mokrej zawiesiny można zastosować trzy różne podejścia: metodę zrównoważonej gęstości (gęstość rozpuszczalnika jest zbliżona do gęstości porowatych cząstek krzemionki), metodę wysokiej lepkości (stosowany jest rozpuszczalnik o wysokiej lepkości) oraz metodę zawiesiny o niskiej lepkości (przeprowadzana z rozpuszczalnikami o niskiej lepkości).

Jako medium do wymiany jonowej stosuje się polistyren. Powstaje z polimeryzacji styrenu z użyciem diwinylobenzenu i nadtlenku benzoilu. Takie wymieniacze tworzą oddziaływania hydrofobowe z białkami, które mogą być nieodwracalne. Ze względu na tę właściwość jonity polistyrenowe nie nadają się do separacji białek. Z drugiej strony są używane do oddzielania małych cząsteczek w separacji aminokwasów i usuwania soli z wody. Do separacji białek można stosować polistyrenowe wymieniacze jonowe z dużymi porami, ale muszą być one pokryte substancją hydrofilową.

Pożywki na bazie celulozy można stosować do separacji dużych cząsteczek, ponieważ zawierają one duże pory. Wiązanie białek w tej pożywce jest wysokie i ma niski charakter hydrofobowy. DEAE to matryca anionowymienna, która jest wytwarzana z dodatniej grupy bocznej dietyloaminoetylu związanego z celulozą lub Sephadexem.

Pożywki na bazie żelu agarozowego również zawierają duże pory, ale ich zdolność substytucji jest mniejsza w porównaniu z dekstranami. Zdolność podłoża do pęcznienia w cieczy opiera się na sieciowaniu tych substancji, pH i stężeniu jonów użytych buforów.

Włączenie wysokiej temperatury i ciśnienia pozwala na znaczne zwiększenie wydajności chromatografii jonowej wraz ze skróceniem czasu. Temperatura ma wpływ na selektywność ze względu na jej wpływ na właściwości retencyjne. Współczynnik retencji ( k = ( t R gt M g )/( t M gt ext )) rośnie wraz z temperaturą dla małych jonów, a odwrotny trend obserwuje się dla większych jonów.

Pomimo selektywności jonowej w różnych ośrodkach, prowadzone są dalsze badania nad wykonaniem chromatografii jonowymiennej w zakresie 40–175°C.

Odpowiedni rozpuszczalnik można wybrać na podstawie obserwacji zachowania cząstek kolumny w rozpuszczalniku. Za pomocą mikroskopu optycznego można łatwo odróżnić pożądany stan zdyspergowania szlamu od zagregowanych cząstek.

Słabe i silne wymieniacze jonowe

„Silny” wymieniacz jonowy nie straci ładunku na swojej matrycy po zrównoważeniu kolumny, dzięki czemu można stosować szeroki zakres buforów pH. „Słabe” wymieniacze jonowe mają zakres wartości pH, w którym utrzymają swój ładunek. Jeżeli pH buforu użytego do słabej kolumny jonowymiennej wyjdzie poza zakres pojemności matrycy, kolumna straci swój rozkład ładunku i cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania może zostać utracona. Pomimo mniejszego zakresu pH słabych wymieniaczy jonowych, często stosuje się je nad silnymi wymieniaczami jonowymi ze względu na ich większą specyficzność. W niektórych eksperymentach czasy retencji słabych wymieniaczy jonowych są wystarczająco długie, aby uzyskać pożądane dane o wysokiej specyficzności.

Żywice (często określane jako „kulki”) kolumn jonowymiennych mogą zawierać grupy funkcyjne, takie jak słabe/mocne kwasy i słabe/mocne zasady. Istnieją również specjalne kolumny zawierające żywice z amfoterycznymi grupami funkcyjnymi, które mogą wymieniać zarówno kationy, jak i aniony. Niektóre przykłady grup funkcyjnych żywic wymieniaczy jonowych są silne czwartorzędowy kation amoniowy (P), który jest wymieniaczem anionowym i kwas (S, SO 2 OH), która jest kwaśny wymieniacz kationowy. Te typy wymienników mogą utrzymywać gęstość ładunku w zakresie pH 0-14. Przykłady grup funkcyjnych słabych żywic jonowymiennych obejmują dietyloaminoetylu (DEAE, -C 2 H 4 N (CH 2 H 5 ) 2 ), który jest wymieniaczem anionowym i karboksymetyl (CM-CH 2 -COOH), który jest wymieniacz kationowy. Te dwa typy wymienników mogą utrzymywać gęstość ładunku w swoich kolumnach w zakresie pH 5-9.

W chromatografii jonowej oddziaływanie jonów substancji rozpuszczonej i fazy stacjonarnej na podstawie ich ładunków określa, które jony będą się wiązać i w jakim stopniu. Gdy w fazie stacjonarnej występują grupy dodatnie, które przyciągają aniony, nazywa się to wymieniaczem anionowym; gdy na fazie stacjonarnej znajdują się grupy ujemne, przyciągane są kationy i jest to wymieniacz kationowy. Przyciąganie między jonami a fazą stacjonarną zależy również od żywicy, cząstek organicznych używanych jako wymieniacze jonów.

Każda żywica charakteryzuje się selektywnością względną, która zmienia się w zależności od obecnych jonów substancji rozpuszczonej, które będą konkurować o wiązanie z grupą żywicy na fazie stacjonarnej. Współczynnik selektywności, równoważny stałej równowagi, jest określany przez stosunek stężeń między żywicą a każdym jonem, jednak ogólna tendencja jest taka, że ​​wymieniacze jonowe preferują wiązanie z jonem o wyższym ładunku, mniejszym promieniu uwodnienia i wyższa polaryzowalność, czyli zdolność do zakłócania chmury elektronowej jonu przez inne ładunki. Pomimo tej selektywności, wprowadzone do kolumny nadmiarowe ilości jonu o niższej selektywności powodowałyby, że mniejszy jon wiązałby się bardziej z fazą stacjonarną, ponieważ współczynnik selektywności umożliwia fluktuacje w reakcji wiązania, która zachodzi podczas chromatografii jonowymiennej.

Poniższa tabela przedstawia powszechnie stosowane wymieniacze jonowe

s. No Nazwa Rodzaj Grupa funkcyjna
1 DEAE Celuloza (Anionit) Słabo podstawowy DEAE (dietyloaminoetyl)
2 QAE Sephadex (wymieniacz anionów) Mocno podstawowy QAE (czwartorzędowy aminoetyl)
3 Q Sepharose (wymieniacz anionów) Mocno podstawowy Q (czwartorzędowy amon)
4 CM-celuloza (kationit) Słabo kwaśny CM (karboksymetyl)
5 SP Sepharose (kationit) Silnie kwaśny SP (sulfopropyl)
6 ŹRÓDŁO S (kationit) Silnie kwaśny S (siarczan metylu)

Typowa technika

Próbka jest wprowadzana ręcznie lub za pomocą automatycznego podajnika próbek do pętli próbki o znanej objętości. Buforowany roztwór wodny znany jako fazy ruchomej przenosi próbkę z pętli na kolumnę, która zawiera jakąś formę materiału fazy stacjonarnej. Jest to typowo żywica lub matryca żelowa składająca się z kulek agarozowych lub celulozowych z kowalencyjnie związanymi naładowanymi grupami funkcyjnymi. Zrównoważenie fazy stacjonarnej jest potrzebne w celu uzyskania pożądanego ładunku kolumny. Jeśli kolumna nie zostanie odpowiednio zrównoważona, pożądana cząsteczka może nie wiązać się silnie z kolumną. Anality docelowe (aniony lub kationy) są zatrzymywane na fazie stacjonarnej, ale mogą być eluowane przez zwiększenie stężenia podobnie naładowanych związków, które wypierają jony analitu z fazy stacjonarnej. Na przykład w chromatografii kationowymiennej dodatnio naładowany analit można wypierać przez dodanie dodatnio naładowanych jonów sodu. Interesujące anality muszą być następnie wykryte pewnymi sposobami, zazwyczaj za pomocą przewodności lub absorbancji UV/światła widzialnego.

Sterowanie systemem IC zwykle wymaga systemu danych chromatograficznych (CDS). Oprócz systemów IC, niektóre z tych CDS mogą również kontrolować chromatografię gazową (GC) i HPLC.

Chromatografia membranowa

Rodzaj chromatografii jonowymiennej, wymiana membranowa, to stosunkowo nowa metoda oczyszczania zaprojektowana w celu przezwyciężenia ograniczeń związanych z użyciem kolumn wypełnionych kulkami. Urządzenia do chromatografii membranowej są tanie w masowej produkcji i jednorazowego użytku w przeciwieństwie do innych urządzeń chromatograficznych, które wymagają konserwacji i czasu na rewalidację. Istnieją trzy rodzaje absorberów membranowych, które są zwykle używane do oddzielania substancji. Te trzy typy to płaski arkusz, puste włókno i przepływ promieniowy. Najpopularniejszym absorberem i najlepiej nadającym się do chromatografii membranowej jest wiele płaskich arkuszy, ponieważ ma większą objętość absorbującą. Może być stosowany do przezwyciężania ograniczeń transferu masy i spadku ciśnienia, co czyni go szczególnie korzystnym do izolacji i oczyszczania wirusów, plazmidowego DNA i innych dużych makrocząsteczek. Kolumna jest wypełniona mikroporowatymi membranami z wewnętrznymi porami, które zawierają ugrupowania adsorpcyjne, które mogą wiązać docelowe białko. Membrany adsorpcyjne są dostępne w różnych geometriach i właściwościach chemicznych, co pozwala na ich stosowanie do oczyszczania, a także frakcjonowania, zatężania i klarowania z wydajnością 10-krotnie wyższą niż przy użyciu kulek. Błony można przygotować poprzez izolację samej membrany, gdzie membrany są cięte na kwadraty i unieruchamiane. Nowsza metoda polegała na wykorzystaniu żywych komórek, które są przyczepione do błony nośnej i są wykorzystywane do identyfikacji i oczyszczania cząsteczek sygnałowych.

Separujące białka

Kolumna jonowymienna w skali preparatywnej stosowana do oczyszczania białek .

Chromatografia jonowymienna może być stosowana do rozdzielania białek, ponieważ zawierają one naładowane grupy funkcyjne. Interesujące jony (w tym przypadku białka naładowane) są wymieniane na inne jony (zwykle H + ) na naładowanym podłożu stałym. Substancje rozpuszczone są najczęściej w fazie ciekłej, którą zwykle jest woda. Weźmy na przykład białka w wodzie, która byłaby fazą ciekłą przepuszczaną przez kolumnę. Kolumna jest powszechnie znana jako faza stała, ponieważ jest wypełniona porowatymi cząstkami syntetycznymi o określonym ładunku. Te porowate cząstki są również określane jako kulki, mogą być aminowane (zawierające grupy aminowe) lub zawierać jony metali w celu nadania ładunku. Kolumnę można przygotować z użyciem porowatych polimerów dla makrocząsteczek 100,000 optymalna wielkość porowatych cząstek wynosi około 1 um 2 . Dzieje się tak, ponieważ powolna dyfuzja substancji rozpuszczonych w porach nie ogranicza jakości rozdzielania. Kulki zawierające dodatnio naładowane grupy, które przyciągają ujemnie naładowane białka, są powszechnie nazywane żywicami anionowymiennymi. Aminokwasy, które mają ujemnie naładowane łańcuchy boczne przy pH 7 (pH wody) to glutaminian i asparaginian. Kulki, które są naładowane ujemnie, nazywane są żywicami kationowymiennymi, ponieważ przyciągane będą białka naładowane dodatnio. Aminokwasy, które mają dodatnio naładowane łańcuchy boczne przy pH 7 to lizyna, histydyna i arginina.

Punkt izoelektryczny to pH, przy którym związek - w tym przypadku białko - nie ma ładunku netto. Punkt izoelektryczny białka lub PI można określić za pomocą pKa łańcuchów bocznych, jeśli grupa aminowa (łańcuch dodatni) jest w stanie zlikwidować łańcuch karboksylowy (ujemny), białko będzie miało wartość PI. Używanie buforów zamiast wody do białek, które nie mają ładunku przy pH 7, jest dobrym pomysłem, ponieważ umożliwia manipulację pH w celu zmiany interakcji jonowych między białkami a kulkami. Słabo kwasowe lub zasadowe łańcuchy boczne mogą mieć ładunek, jeśli pH jest odpowiednio wysokie lub wystarczająco niskie. Separację można osiągnąć na podstawie naturalnego punktu izoelektrycznego białka. Alternatywnie znacznik peptydowy może być genetycznie dodany do białka, aby nadać białku punkt izoelektryczny z dala od większości naturalnych białek (np. 6 arginin do wiązania z żywicą kationowymienną lub 6 glutaminianów do wiązania z żywicą anionowymienną, taką jak DEAE -Sefaroza).

Elucja poprzez zwiększenie siły jonowej fazy ruchomej jest bardziej subtelna. Działa, ponieważ jony z fazy ruchomej oddziałują z jonami unieruchomionymi na fazie stacjonarnej, „osłaniając” fazę stacjonarną przed białkiem i pozwalając białku na elucję.

Elucja z kolumn jonowymiennych może być wrażliwa na zmiany pojedynczego ładunku – chromatoogniskowanie . Chromatografia jonowymienna jest również przydatna w izolacji specyficznych multimerycznych zespołów białkowych, umożliwiając oczyszczanie specyficznych kompleksów zarówno w zależności od liczby, jak i położenia naładowanych znaczników peptydowych.

Efekt Gibbsa-Donnana

W chromatografii jonowymiennej efekt Gibbsa-Donnana obserwuje się, gdy pH zastosowanego buforu i wymieniacza jonowego różni się, nawet do jednej jednostki pH. Na przykład w kolumnach anionowymiennych wymieniacze jonowe odwracają protony, więc pH buforu w pobliżu kolumny różni się, jest wyższe niż w pozostałej części rozpuszczalnika. W rezultacie eksperymentator musi uważać, aby białko(a) będące przedmiotem zainteresowania było stabilne i odpowiednio naładowane w „rzeczywistym” pH.

Efekt ten wynika z tego, że dwie podobnie naładowane cząstki, jedna z żywicy, a druga z roztworu, nie rozprowadzają się prawidłowo między dwiema stronami; istnieje selektywne pobieranie jednego jonu w stosunku do drugiego. Na przykład, w sulfonowanej żywicy polistyrenowej, żywicy kationowymiennej, jon chloru w buforze kwasu chlorowodorowego powinien zrównoważyć się w żywicy. Jednakże, ponieważ stężenie kwasu sulfonowego w żywicy jest wysokie, wodór HCl nie ma tendencji do wchodzenia do kolumny. To, w połączeniu z potrzebą elektroneutralności, prowadzi do minimalnej ilości wodoru i chloru wchodzącej do żywicy.

Zastosowania

Użyteczność kliniczna

Zastosowanie chromatografii jonowej można zaobserwować w chromatografii argentacyjnej . Zazwyczaj srebro i związki zawierające wiązania acetylenowe i etylenowe mają bardzo słabe oddziaływania. Zjawisko to zostało szeroko przetestowane na związkach olefinowych. Kompleksy jonowe tworzone przez olefiny z jonami srebra są słabe i powstają w oparciu o nakładanie się orbitali pi, sigma i d, a zatem dostępne elektrony nie powodują rzeczywistych zmian w podwójnym wiązaniu. To zachowanie zostało zmanipulowane w celu oddzielenia lipidów, głównie kwasów tłuszczowych, z mieszanin na frakcje o różnej liczbie wiązań podwójnych przy użyciu jonów srebra. Żywice jonowe impregnowano jonami srebra, które następnie poddano działaniu różnych kwasów (kwasu krzemowego) w celu wymycia kwasów tłuszczowych o różnej charakterystyce.

Dla jonów metali alkalicznych można uzyskać granice wykrywalności tak niskie, jak 1 μM. Może być stosowany do pomiaru HbA1c , porfiryny oraz do oczyszczania wody . Żywice jonowymienne (IER) są szeroko stosowane zwłaszcza w medycynie ze względu na ich dużą wydajność i nieskomplikowany system procesu separacji. Jednym z syntetycznych zastosowań jest użycie żywic jonowymiennych do dializy nerek. Ta metoda służy do oddzielania elementów krwi za pomocą sztucznej nerki z błoną celulozową.

Innym klinicznym zastosowaniem chromatografii jonowej jest technika szybkiej chromatografii anionowymiennej, stosowana do oddzielania izoenzymów kinazy kreatynowej (CK) od ludzkiej surowicy i tkanek pobranych z materiału z autopsji (użyto głównie tkanek bogatych w CK, takich jak mięsień sercowy i mózg). Te izoenzymy obejmują MM, MB i BB, które pełnią tę samą funkcję przy różnych sekwencjach aminokwasów. Zadaniem tych izoenzymów jest przekształcanie kreatyny za pomocą ATP w fosfokreatynę wydalającą ADP. Minikolumny wypełniono DEAE-Sephadex A-50 i dalej eluowano tris-buforem chlorku sodu w różnych stężeniach (każde stężenie zostało wybrane korzystnie do manipulacji elucją). Ekstrakt z tkanki ludzkiej wprowadzono do kolumn w celu rozdzielenia. Wszystkie frakcje zostały przeanalizowane, aby zobaczyć całkowitą aktywność CK i stwierdzono, że każde źródło izoenzymów CK zawiera charakterystyczne izoenzymy znajdujące się wewnątrz. Najpierw eluowano CK-MM, następnie CK-MB, a następnie CK-BB. W związku z tym izoenzymy znajdujące się w każdej próbce można wykorzystać do identyfikacji źródła, ponieważ są one specyficzne dla tkanki.

Korzystając z informacji uzyskanych z wyników, można było dokonać korelacji między diagnozą pacjentów a rodzajem izoenzymów CK występujących w największej aktywności. Z odkrycia wynika, że ​​około 35 z 71 badanych pacjentów cierpiało na atak serca (zawał mięśnia sercowego) również zawierało obfite ilości izoenzymów CK-MM i CK-MB. Wyniki pokazują ponadto, że w wielu innych diagnozach, w tym niewydolności nerek, chorobach naczyń mózgowych i chorobach płuc, stwierdzono jedynie obecność izoenzymu CK-MM, a nie żadnego innego izoenzymu. Wyniki tego badania wskazują na korelacje między różnymi chorobami a znalezionymi izoenzymami CK, co potwierdza wcześniejsze wyniki badań różnymi technikami. Badania nad CK-MB wykrytymi u ofiar ataku serca rozszerzyły się od czasu tego badania i zastosowania chromatografii jonowej.

Zastosowania przemysłowe

Od 1975 roku chromatografia jonowa jest szeroko stosowana w wielu gałęziach przemysłu. Główne zalety to niezawodność, bardzo dobra dokładność i precyzja, wysoka selektywność, duża prędkość, wysoka skuteczność separacji oraz niski koszt materiałów eksploatacyjnych. Najważniejszym osiągnięciem związanym z chromatografią jonową są nowe metody przygotowania próbek; poprawa szybkości i selektywności rozdzielania analitów; obniżenie granic wykrywalności i granic oznaczania ilościowego; rozszerzenie zakresu aplikacji; opracowanie nowych standardowych metod; miniaturyzacja i rozszerzenie zakresu analizy nowej grupy substancji. Umożliwia ilościowe badanie elektrolitu i własnych dodatków do kąpieli galwanicznych . Jest to postęp w jakościowych testach ogniw kadłuba lub mniej dokładnych testach UV. Można mierzyć jony, katalizatory, rozjaśniacze i przyspieszacze. Chromatografia jonowymienna stopniowo stała się powszechnie znaną, uniwersalną techniką wykrywania zarówno anionów, jak i kationów. Aplikacje do takich celów zostały opracowane lub są w trakcie opracowywania dla różnych dziedzin zainteresowania, w szczególności dla przemysłu farmaceutycznego. Zastosowanie chromatografii jonowymiennej w farmaceutykach wzrosło w ostatnich latach, aw 2006 r. rozdział dotyczący chromatografii jonowymiennej został oficjalnie dodany do Farmakopei Stanów Zjednoczonych – National Formulary (USP-NF). Ponadto, w wydaniu USP-NF z 2009 r., Farmakopia Stanów Zjednoczonych udostępniła kilka analiz chromatografii jonowej przy użyciu dwóch technik: detekcji przewodnictwa oraz pulsacyjnej detekcji amperometrycznej . Większość z tych aplikacji służy przede wszystkim do pomiaru i analizy limitów pozostałości w farmaceutykach, w tym do wykrywania limitów szczawianu, jodku, siarczanu, amidosulfonianu, fosforanu, a także różnych elektrolitów, w tym potasu i sodu. W sumie w edycji USP-NF z 2009 r. oficjalnie udostępniono dwadzieścia osiem metod wykrywania do analizy związków aktywnych lub składników związków aktywnych, wykorzystujących detekcję przewodnictwa lub pulsacyjną detekcję amperometryczną.

Rozwój leków

System chromatografii jonowej używany do wykrywania i pomiaru kationów, takich jak sód, amon i potas w preparatach na kaszel wykrztuśny.

Rośnie zainteresowanie zastosowaniem IC w analizie leków farmaceutycznych. IC jest używany w różnych aspektach rozwoju produktu i testowania kontroli jakości. Na przykład IC służy do poprawy stabilności i właściwości rozpuszczalności cząsteczek farmaceutycznych leków aktywnych, a także do wykrywania układów, które mają wyższą tolerancję na rozpuszczalniki organiczne. IC był używany do oznaczania analitów jako część testu rozpuszczania. Na przykład testy rozpuszczania wapnia wykazały, że inne jony obecne w pożywce mogą być dobrze rozdzielone między sobą, a także z jonu wapnia. Dlatego IC został zastosowany w lekach w postaci tabletek i kapsułek w celu określenia ilości rozpuszczonego leku w czasie. IC jest również szeroko stosowany do wykrywania i oznaczania ilościowego zaróbek lub składników nieaktywnych stosowanych w preparatach farmaceutycznych. Wykrywanie cukru i alkoholu cukrowego w takich formulacjach przez IC zostało wykonane ze względu na rozkład tych grup polarnych w kolumnie jonowej. Metodologia IC ustalona również w analizie zanieczyszczeń w substancjach i produktach leczniczych. Zanieczyszczenia lub jakiekolwiek składniki, które nie są częścią substancji chemicznej leku, są oceniane i dają wgląd w maksymalne i minimalne ilości leku, które powinny być podawane pacjentowi dziennie.

Zobacz też

Bibliografia

Bibliografia

Linki zewnętrzne