Lizozym - Lysozyme
| Hydrolaza glikozydowa, rodzina 22, lizozym | |
|---|---|
 Kryształy lizozymu barwione błękitem metylenowym .
| |
| Identyfikatory | |
| Symbol | ? |
| InterPro | IPR000974 |
| Lizozym | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Identyfikatory | |||||||||
| Nr WE | 3.2.1.17 | ||||||||
| Nr CAS | 9001-63-2 | ||||||||
| Bazy danych | |||||||||
| IntEnz | Widok IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Wpis BRENDY | ||||||||
| ExPASy | Widok NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Wpis KEGG | ||||||||
| MetaCyc | szlak metaboliczny | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| Struktury WPB | RCSB PDB PDBe Suma PDB | ||||||||
| Ontologia genów | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
Lizozym , znany również jako muramidaza lub glikanhydrolaza N- acetylmuramidowa , jest wytwarzanym przez zwierzęta enzymem przeciwdrobnoustrojowym , który stanowi część wrodzonego układu odpornościowego . Lizozym jest hydrolazą glikozydową, która katalizuje hydrolizę wiązań 1,4-beta między kwasem N-acetylomuraminowym a resztami N-acetylo-D-glukozaminy w peptydoglikanie , który jest głównym składnikiem ściany komórkowej bakterii gram-dodatnich . Ta hydroliza z kolei narusza integralność ścian komórkowych bakterii, powodując ich lizę .
Lizozym jest obfity w wydzieliny, w tym łzy , ślinę , ludzkie mleko i śluz . Występuje również w ziarnistościach cytoplazmatycznych makrofagów i neutrofilach wielojądrzastych (PMN). W białku jaja znajdują się duże ilości lizozymu . Lizozymy typu C są blisko spokrewnione z alfa-laktoalbuminą pod względem sekwencji i struktury, co czyni je częścią tej samej rodziny hydrolaz glikozydowych22 . U ludzi enzym lizozymowy typu C jest kodowany przez gen LYZ .
Lizozym z białka jaja kurzego jest stabilny termicznie, a jego temperatura topnienia dochodzi do 72 °C przy pH 5,0. Jednak lizozym w mleku ludzkim bardzo szybko traci aktywność w tej temperaturze. Lizozym białka jaja kurzego utrzymuje swoją aktywność w szerokim zakresie pH (6-9). Jego punkt izoelektryczny to 11,35. Punkt izoelektryczny lizozymu mleka ludzkiego wynosi 10,5-11.
Funkcja i mechanizm
Działanie enzymu polega na hydrolizie wiązań glikozydowych w peptydoglikanach . Enzym może również rozrywać wiązania glikozydowe w chitynie , chociaż nie tak skutecznie jak prawdziwe chitynazy .
Miejsce aktywne lizozymu wiąże cząsteczkę peptydoglikanu w widocznej szczelinie między jej dwiema domenami. Atakuje peptydoglikany (znajdujące się w ścianach komórkowych bakterii, zwłaszcza Gram-dodatnich ), swój naturalny substrat, pomiędzy kwasem N- acetylomuraminowym (NAM) a czwartym atomem węgla N-acetyloglukozaminy (NAG).
Krótsze sacharydy, takie jak tetrasacharyd, również okazały się żywotnymi substratami, ale poprzez produkt pośredni o dłuższym łańcuchu. Wykazano również, że chityna jest żywotnym substratem lizozymu. W lizozymie opracowano również i zastosowano sztuczne podłoża.
Mechanizm
Phillips
Mechanizm Phillipsa zasugerował, że moc katalityczna enzymu pochodziła zarówno ze sterycznego szczepu na związanym substracie, jak i elektrostatycznej stabilizacji okso-karbeniumowego związku pośredniego. Na podstawie rentgenowskich danych krystalograficznych Phillips zaproponował miejsce aktywne enzymu, w którym wiąże się heksasacharyd. Lizozym zniekształca czwarty cukier (w podmiejscu D lub -1) w heksasacharydzie do konformacji półkrzesła. W tym stanie stresu wiązanie glikozydowe jest łatwiejsze do zerwania. W wyniku zerwania wiązania glikozydowego powstaje jonowy produkt pośredni zawierający okso-karbenium . Tak więc zniekształcenie powodujące, że cząsteczka substratu przyjmie naprężoną konformację podobną do stanu przejściowego, obniży barierę energetyczną reakcji.
Arieh Warshel w 1978 r. spekulował, że proponowany półprodukt okso-karbonowy jest stabilizowany elektrostatycznie przez reszty asparaginianowe i glutaminianowe w miejscu aktywnym. Argument dotyczący stabilizacji elektrostatycznej opierał się na porównaniu z wodą w masie, reorientacja dipoli wody może zniwelować energię stabilizacji interakcji ładunku. W modelu Warshela enzym działa jak superrozpuszczalnik, który ustala orientację par jonowych i zapewnia supersolwatację (bardzo dobrą stabilizację par jonowych), a zwłaszcza obniża energię, gdy dwa jony są blisko siebie.
Etap determinujący szybkość (RDS) w tym mechanizmie jest związany z tworzeniem związku pośredniego okso-karbenium . Było kilka sprzecznych wyników wskazujących na dokładny RDS. Śledząc powstawanie produktu ( p-nitrofenolu ), odkryto, że RDS może zmieniać się w różnych temperaturach, co było przyczyną tych sprzecznych wyników. W wyższej temperaturze RDS jest tworzeniem pośredniego enzymu glikozylowego, aw niższej temperaturze rozpadem tego związku pośredniego.
Koshland
We wczesnej debacie w 1969 Dahlquist zaproponował mechanizm kowalencyjny dla lizozymu oparty na kinetycznym efekcie izotopowym , ale przez długi czas mechanizm jonowy był bardziej akceptowany. W 2001 r. Vocadlo zaproponował zmieniony mechanizm za pomocą kowalencyjnego, ale nie jonowego produktu pośredniego. Dowody z analizy ESI - MS wskazują na kowalencyjny związek pośredni. Substrat 2-fluoro-podstawiony zastosowano do obniżenia szybkości reakcji i akumulacji półproduktu do charakteryzacji. Stwierdzono, że łańcuchy boczne aminokwasów kwas glutaminowy 35 (Glu35) i asparaginian 52 (Asp52) są krytyczne dla aktywności tego enzymu. Glu35 działa jako donor protonów do wiązania glikozydowego, rozszczepiając wiązanie CO w substracie, podczas gdy Asp52 działa jako nukleofil, generując pośredni enzym glikozylowy. Glu35 reaguje z wodą, tworząc jon hydroksylowy, silniejszy nukleofil niż woda, który następnie atakuje pośredni enzym glikozylowy, dając produkt hydrolizy i pozostawiając enzym niezmieniony. Ten mechanizm kowalencyjny został nazwany na cześć Koshlanda , który jako pierwszy zaproponował ten rodzaj mechanizmu.
Ostatnio, symulacje dynamiki molekularnej mechaniki kwantowej/mechaniki molekularnej (QM/MM) wykorzystywały kryształ HEWL i przewidywały istnienie kowalencyjnego związku pośredniego. Dowody na struktury ESI-MS i rentgenowskie wskazują na istnienie kowalencyjnego związku pośredniego, ale przede wszystkim opierają się na użyciu mniej aktywnego zmutowanego lub obcego substratu. Zatem dynamika molekularna QM/MM zapewnia wyjątkową zdolność do bezpośredniego badania mechanizmu HEWL typu dzikiego i natywnego substratu. Obliczenia wykazały, że kowalencyjny związek pośredni z mechanizmu Koshlanda jest o ~30 kcal/mol bardziej stabilny niż jonowy związek pośredni z mechanizmu Phillipsa. Obliczenia te pokazują, że jonowy związek pośredni jest wyjątkowo niekorzystny pod względem energetycznym, a kowalencyjne związki pośrednie obserwowane w eksperymentach z użyciem mniej aktywnych zmutowanych lub nienatywnych substratów zapewniają użyteczny wgląd w mechanizm HEWL typu dzikiego.
Zahamowanie
Pochodne imidazolu mogą tworzyć kompleks z przeniesieniem ładunku z niektórymi resztami (w centrum aktywnym lub poza nim) w celu uzyskania konkurencyjnego hamowania lizozymu. W bakterii Gram-ujemnych , lipopolisacharyd działa jako niekonkurencyjnych inhibitior przez bardzo korzystnych warunkach wiązanie z lizozymu.
Działanie nieenzymatyczne
Mimo że uważa się, że aktywność muramidazy lizozymu odgrywa kluczową rolę w jego właściwościach przeciwbakteryjnych, doniesiono również o jego nieenzymatycznym działaniu. Na przykład, blokowanie aktywności katalitycznej lizozymu przez mutację krytycznego aminokwasu w miejscu aktywnym (52- Asp -> 52- Ser ) nie eliminuje jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Lektynowy, jak zdolność do rozpoznawania antygenu lizozymu węglowodanów bakterii, pozbawioną aktywności litycznej cechowała tetrasacharydu związanego z lipopolisacharydu z Klebsiella pneumoniae . Ponadto, lizozym współdziała z przeciwciała i receptory komórek T .
Zmiany konformacji enzymów
Lizozym wykazuje dwie konformacje: otwarty stan aktywny i zamknięty stan nieaktywny. Znaczenie katalityczne zbadano za pomocą tranzystorów polowych (FET) z jednościennych nanorurek węglowych (SWCN), gdzie pojedynczy lizozym był związany z tranzystorem FET SWCN. Elektroniczne monitorowanie lizozymu wykazało dwie konformacje, otwarte miejsce aktywne i zamknięte miejsce nieaktywne. W stanie aktywnym lizozym jest w stanie procesowo hydrolizować swój substrat, rozrywając średnio 100 wiązań z szybkością 15 na sekundę. Wiązanie nowego substratu i przejście z zamkniętego stanu nieaktywnego do otwartego stanu aktywnego wymaga dwustopniowej zmiany konformacji, podczas gdy inaktywacja wymaga jednego etapu.
Rola w chorobie i terapii
Lizozym jest częścią wrodzonego układu odpornościowego. Zmniejszone poziomy lizozymu są związane z dysplazją oskrzelowo-płucną u noworodków. Prosięta karmione ludzkim mlekiem lizozymowym mogą szybciej wyzdrowieć z choroby biegunkowej wywołanej przez E. coli . Stężenie lizozymu w mleku ludzkim jest 1600 do 3000 razy większe niż w mleku zwierzęcym. Ludzki lizozym jest bardziej aktywny niż lizozym z białka jaja kurzego. Transgeniczna linia kóz (z założycielem nazwie „Artemis”) zostały opracowane do mleka spożywczego z ludzkiego lizozymu, aby chronić dzieci z biegunką, jeśli nie mogą czerpać korzyści z ludzkiej karmienia piersią.
Ponieważ lizozym jest naturalną formą ochrony przed bakteriami Gram-dodatnimi, takimi jak Bacillus i Streptococcus , odgrywa ważną rolę w immunologii niemowląt karmionych mlekiem kobiecym. Podczas gdy skóra stanowi barierę ochronną ze względu na swoją suchość i kwasowość, spojówkę (błonę pokrywającą oko) chronią natomiast wydzielane enzymy, głównie lizozym i defensyna . Jednak, gdy te bariery ochronne zawodzą, dochodzi do zapalenia spojówek .
W niektórych nowotworach (zwłaszcza białaczkach mielomonocytowych) nadmierna produkcja lizozymu przez komórki nowotworowe może prowadzić do toksycznego poziomu lizozymu we krwi. Wysoki poziom lizozymu we krwi może prowadzić do niewydolności nerek i niskiego poziomu potasu we krwi, stanów, które mogą ulec poprawie lub ustąpić podczas leczenia pierwotnego nowotworu złośliwego.
Lizozym w surowicy jest znacznie mniej specyficzny w diagnostyce sarkoidozy niż enzym konwertujący angiotensynę w surowicy; jednak ponieważ jest bardziej czuły, jest używany jako marker aktywności choroby sarkoidozy i jest odpowiedni do monitorowania choroby w udowodnionych przypadkach.
Synteza chemiczna
Pierwszej chemicznej syntezy białka lizozymu podjął się prof. George W. Kenner i jego grupa na Uniwersytecie w Liverpoolu w Anglii. Zostało to ostatecznie osiągnięte w 2007 roku przez Thomasa Dureka w laboratorium Steve'a Kenta na Uniwersytecie w Chicago, który stworzył syntetyczną funkcjonalną cząsteczkę lizozymu.
Inne aplikacje
Kryształy lizozymu zostały wykorzystane do wyhodowania innych materiałów funkcjonalnych do katalizy i zastosowań biomedycznych. Lizozym jest powszechnie stosowanym enzymem do lizy bakterii Gram-dodatnich. Ze względu na wyjątkową funkcję lizozymu, polegającą na tym, że może trawić ścianę komórkową i wywołuje wstrząs osmotyczny (rozrywa komórkę przez nagłą zmianę stężenia substancji rozpuszczonej wokół komórki, a tym samym ciśnienia osmotycznego ), lizozym jest powszechnie stosowany w warunkach laboratoryjnych do uwalniania białek z bakterii peryplazma, podczas gdy wewnętrzna błona pozostaje zamknięta jako pęcherzyki zwane sferoplastami .
Na przykład E. coli można poddać lizie przy użyciu lizozymu w celu uwolnienia zawartości przestrzeni peryplazmatycznej . Jest to szczególnie przydatne w warunkach laboratoryjnych do prób zebrania zawartości peryplazmy. Obróbka lizozymem jest optymalna w określonych temperaturach, zakresach pH i stężeniach soli. Aktywność lizozymu wzrasta wraz ze wzrostem temperatury, do 60 stopni Celsjusza, przy pH w zakresie 6,0-7,0. Obecne sole wpływają również na obróbkę lizozymem, gdzie niektóre zapewniają działanie hamujące, a inne promują lizę poprzez obróbkę lizozymem. Chlorek sodu indukuje lizę, ale w wysokich stężeniach jest aktywnym inhibitorem lizy. Podobne obserwacje zaobserwowano przy użyciu soli potasowych. Występują niewielkie różnice spowodowane różnicami w szczepach bakteryjnych.
Historia
Właściwości przeciwbakteryjne białka jaja kurzego, ze względu na zawarty w nim lizozym, po raz pierwszy zaobserwował Laschtschenko w 1909 roku. Bakteryjne działanie śluzu nosowego zademonstrował w 1922 roku Alexander Fleming , odkrywca penicyliny , który ukuł termin lizozym. — zameldował Fleming. „Ponieważ substancja ta ma właściwości zbliżone do właściwości fermentów, nazwałem ją »lizozymem«”. Fleming wykazał, że substancja enzymatyczna jest obecna w wielu różnych wydzielinach i jest zdolna do szybkiej lizy (tj. rozpuszczania) różnych bakterii, szczególnie żółtego „kokusu”, który badał”.
Lizozym został po raz pierwszy skrystalizowany przez Edwarda Abrahama w 1937 r., umożliwiając opisanie trójwymiarowej struktury lizozymu z białka jaja kurzego przez Davida Chiltona Phillipsa w 1965 r., kiedy uzyskał pierwszy model rozdzielczości 2 angström (200 pm ) za pomocą krystalografii rentgenowskiej . Struktura została publicznie zaprezentowana na wykładzie Royal Institution w 1965 roku. Lizozym był drugą strukturą białkową i pierwszą strukturą enzymatyczną, którą rozwiązano metodami dyfrakcji rentgenowskiej, a także pierwszym enzymem, który został w pełni zsekwencjonowany, zawierającym wszystkie dwadzieścia powszechnych aminokwasów. W wyniku wyjaśnienia przez Phillipsa struktury lizozymu był to również pierwszy enzym, który posiadał szczegółowy, specyficzny mechanizm sugerowany dla jego metody katalitycznego działania. Ta praca doprowadziła Phillipsa do wyjaśnienia, w jaki sposób enzymy przyspieszają reakcję chemiczną pod względem jej struktur fizycznych. Oryginalny mechanizm zaproponowany przez Phillipsa został niedawno zmieniony.
Zobacz też
Bibliografia
Zewnętrzne linki
- Muramidaza w Narodowej Bibliotece Medycznej USA Medical Subject Headings (MeSH)
- Proteopedia.org HEW Lizozym
- PDBe-KB zawiera przegląd wszystkich informacji o strukturze dostępnych w PDB dla ludzkiego lizozymu C.
- PDBe-KB zawiera przegląd wszystkich informacji o strukturze dostępnych w PDB dla białka jaja kurzego Lizozym C.
