Analiza krzywej topnienia - Melting curve analysis

Analiza krzywej topnienia jest oceną charakterystyki dysocjacji dwuniciowego DNA podczas ogrzewania. Wraz ze wzrostem temperatury podwójna nić zaczyna dysocjować, prowadząc do wzrostu intensywności absorbancji, hiperchromiczności . Temperatura, w której 50% DNA ulega denaturacji, nazywana jest temperaturą topnienia .

Zebrane informacje można wykorzystać do wnioskowania o obecności i tożsamości polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP). Dzieje się tak, ponieważ pary zasad GC mają między sobą 3 wiązania wodorowe, podczas gdy pary zasad AT mają tylko 2. DNA o wyższej zawartości GC, czy to ze względu na jego źródło (zawartość GC: E. coli 0,50, M. luteus 0,72, poli d (AT ) 0,00) lub, jak wspomniano wcześniej, z powodu SNP, będzie miał wyższą temperaturę topnienia niż DNA o wyższej zawartości AT.

Informacje dostarczają również ważnych wskazówek dotyczących sposobu interakcji cząsteczki z DNA. Cząsteczki, takie jak interkalatory, wsuwają się między pary zasad i oddziałują poprzez układanie pi . Ma to stabilizujący wpływ na strukturę DNA, co prowadzi do wzrostu jego temperatury topnienia. Podobnie, rosnące stężenia soli pomagają rozpraszać negatywne odpychanie między fosforanami w kręgosłupie DNA. Prowadzi to również do wzrostu temperatury topnienia DNA. Odwrotnie, pH może mieć negatywny wpływ na stabilność DNA, co może prowadzić do obniżenia jego temperatury topnienia.

Realizacja

Wykresy pokazujące zależność między fluorescencją a temperaturą dla znakowanej sondy zaprojektowanej dla sekwencji Wt, homozygotycznej Wt, heterozygotycznej i homozygotycznej mutacji

Energia wymagana do zerwania wiązania wodorowego zasada-zasada między dwiema niciami DNA zależy od ich długości, zawartości GC i ich komplementarności. Ogrzewając mieszaninę reakcyjną zawierającą dwuniciowe sekwencje DNA i mierząc dysocjację względem temperatury, można wywnioskować te cechy.

Początkowo dysocjację nici obserwowano za pomocą pomiarów absorbancji UV, ale obecnie najpowszechniejszym podejściem są techniki oparte na pomiarach fluorescencji.

Zależną od temperatury dysocjację między dwiema niciami DNA można zmierzyć za pomocą fluoroforu interkalującego DNA, takiego jak SYBR green , EvaGreen lub sond DNA znakowanych fluoroforem . W przypadku zieleni SYBR (która fluoryzuje 1000-krotnie intensywniej, gdy jest interkalowana w mniejszym rowku dwóch nici DNA) dysocjację DNA podczas ogrzewania można zmierzyć poprzez duże zmniejszenie fluorescencji, która powoduje. Alternatywnie do określenia komplementarności sondy z sekwencją docelową można zastosować sondy umieszczone obok siebie (jedna z fluoroforem, a druga z odpowiednim wygaszaczem ).

Wykres ujemnej pierwszej pochodnej krzywej topnienia może ułatwić dokładne określenie temperatury dysocjacji (zdefiniowanej jako 50% dysocjacji) dzięki tak utworzonym pikom.

SYBR Green umożliwił różnicowanie produktów w LightCycler w 1997 roku. Wykazano również, że sondy hybrydyzacyjne (lub sondy FRET) zapewniają bardzo specyficzne krzywe topnienia z jednoniciowej (ss) hybrydy sonda-amplikon. Idaho Technology i Roche zrobiły wiele, aby spopularyzować to zastosowanie w instrumencie LightCycler.

Aplikacje

Od późnych lat 90-tych analiza produktu za pomocą SYBR Green, innych barwników specyficznych dla podwójnej nici lub analiza krzywej topnienia oparta na sondach stała się prawie wszechobecna. Techniki oparte na sondzie jest wystarczająco czuły aby wykryć polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), może rozróżniać homozygotycznego typu dzikiego , heterozygotycznych i homozygotycznych zmutowanych alleli na podstawie wzorców wytwarzanych dysocjacji. Bez sond topienie amplikonu (topienie i analiza całego produktu PCR) na ogół nie przyniosło sukcesu w znalezieniu pojedynczych wariantów zasad na podstawie profili topnienia. Dzięki instrumentom o wyższej rozdzielczości i zaawansowanym barwnikom, analiza topnienia amplikonu jednego wariantu podstawowego jest teraz możliwa przy użyciu kilku dostępnych na rynku instrumentów. Na przykład: Applied Biosystems 7500 Fast System i 7900HT Fast Real-Time PCR System, LightScanner firmy Idaho Technology (pierwsze płytkowe urządzenie topiące o wysokiej rozdzielczości), instrumenty Rotor-Gene firmy Qiagen i instrumenty Roche's LightCycler 480.

W literaturze istnieje wiele badań i przykładów klinicznych, które pokazują zastosowanie analizy krzywej topnienia w celu uniknięcia lub uzupełnienia wysiłków związanych z sekwencjonowaniem, a tym samym obniżenia kosztów.

Podczas gdy większość maszyn do ilościowego PCR ma opcję generowania i analizy krzywej topnienia, poziom analizy i obsługi oprogramowania jest różny. Topienie o wysokiej rozdzielczości (znane jako topienie o wysokiej rozdzielczości lub HRM) jest postępem w tej ogólnej technologii i zaczęło oferować wyższą czułość wykrywania SNP w całym amplikonie barwionym barwnikiem. Opracowanie systemów krzywych topnienia bez proble- mów jest tańsze i prostsze w projektowaniu. Jednak w przypadku zastosowań związanych z genotypowaniem, w których konieczne jest przetworzenie dużych ilości próbek, koszt opracowania może być mniej ważny niż całkowita przepustowość i łatwość interpretacji, co sprzyja metodom genotypowania opartym na sondach.

Zobacz też

Bibliografia

Linki zewnętrzne