Nuklearny efekt Overhausera - Nuclear Overhauser effect

Jądrowy efekt Overhausera ( NOE ) jest transfer jądrowy podziału polaryzacji z jednej populacji wirowania czynne zarodków (na przykład 1 H, 13 ° C, 15 N itd.) Do drugiego za pomocą poprzecznego relaksacji . Fenomenologiczna definicja NOE w spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) to zmiana zintegrowanego natężenia (dodatnia lub ujemna) jednego rezonansu NMR, która występuje, gdy inny jest nasycony przez napromieniowanie polem RF . Zmiana intensywności rezonansu jądra jest konsekwencją zbliżania się jądra w przestrzeni do tych, na które bezpośrednio wpływają zaburzenia RF.

NOE jest szczególnie ważne w wyznaczaniu rezonansów NMR oraz wyjaśnianiu i potwierdzaniu struktur lub konfiguracji cząsteczek organicznych i biologicznych. 1 H dwuwymiarowy NOE spektroskopii (NOESY) eksperymentem i jej rozwinięcia są ważnym narzędziem do identyfikacji stereochemię białek i innych cząsteczek biologicznych w roztworze, natomiast w stałej postaci krystalicznej dyfrakcji rentgenowskiej na ogół używane do identyfikacji stereochemię. Heterojądrowy NOE jest szczególnie ważny w spektroskopii 13 C NMR w celu identyfikacji węgli związanych z protonami, zapewnienia wzmocnienia polaryzacji takim węglom w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu i ustalenia stopnia, w jakim relaksacja tych węgli jest kontrolowana przez dipol-dipol mechanizm relaksacyjny.

Historia

NOE rozwinął się na podstawie prac teoretycznych amerykańskiego fizyka Alberta Overhausera, który w 1953 roku zaproponował, że polaryzację spinu jądrowego można wzmocnić przez napromieniowanie mikrofalami elektronów przewodzących w niektórych metalach. Wzmocnienie elektronowo-jądrowe przewidywane przez Overhausera zostało eksperymentalnie zademonstrowane w metalu 7 Li przez TR Carvera i CP Slichtera również w 1953 roku. Ogólne podstawy teoretyczne i doświadczalne obserwacje efektu Overhausera obejmującego tylko spiny jądrowe w cząsteczce HF zostały opublikowane przez Ionela Solomona w 1955. Kolejna wczesna obserwacja eksperymentalna NOE została wykorzystana przez Kaisera w 1963 roku, aby pokazać, w jaki sposób NOE może być używany do wyznaczania względnych znaków stałych sprzężenia skalarnego oraz do przypisywania linii widmowych w widmach NMR do przejść między poziomami energii. W tym badaniu rezonans jednej populacji protonów ( 1 H) w cząsteczce organicznej został wzmocniony, gdy druga odrębna populacja protonów w tej samej cząsteczce organicznej została nasycona promieniowaniem RF. Aplikacja NOE została wykorzystana przez Anet i Bourn w 1965 do potwierdzenia przypisania rezonansów NMR dla kwasu β,β-dimetyloakrylowego i dimetyloformamidu, pokazując w ten sposób, że można uzyskać informacje o konformacji i konfiguracji cząsteczek organicznych w roztworze. Bell i Saunders donieśli o bezpośredniej korelacji między wzmocnieniami NOE a odległościami międzyjądrowymi w 1970 roku, podczas gdy ilościowe pomiary odległości międzyjądrowych w cząsteczkach o trzech lub więcej spinach zostały opisane przez Schirmera i in.

Richard R. Ernst otrzymał w 1991 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za opracowanie transformaty Fouriera i dwuwymiarowej spektroskopii NMR , która wkrótce została zaadaptowana do pomiaru NOE, szczególnie w dużych cząsteczkach biologicznych. W 2002 roku Kurt Wuthrich zdobył Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za opracowanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w celu określenia trójwymiarowej struktury makrocząsteczek biologicznych w roztworze, demonstrując, w jaki sposób metoda 2D NOE (NOESY) może być stosowana do ograniczania trójwymiarowości struktury dużych makrocząsteczek biologicznych. Profesor Anil Kumar jako pierwszy zastosował dwuwymiarowy eksperyment jądrowy Overhauser Effect (2D-NOE, obecnie znany jako NOESY) do biomolekuły, co otworzyło pole do określania trójwymiarowych struktur biomolekuł w roztworze za pomocą spektroskopii NMR.

Relaks

Wirowania wykres poziomu energii jądrowej dla dwóch korkociągu 1 / 2 jąder.
Sekwencja impulsów w stanie ustalonym dla eksperymentów 1 H NOE

NOE i jądrowa relaksacja spin-sieć są ściśle powiązanymi zjawiskami. Dla pojedynczego wirowego 1 / 2 pierścienia w polu magnetycznym są dwa poziomy energetyczne, które są często oznaczone a i P, które są zgodne z dwóch możliwych stanów wirowania kwantowej, + 1 / 2 i - 1 / 2 , odpowiednio. W równowadze termicznej populacja dwóch poziomów energetycznych jest określona przez rozkład Boltzmanna z populacjami spinowymi podanymi przez P α i P β . Jeśli populacje spinowe są zaburzone przez odpowiednie pole RF o częstotliwości energii przejścia, populacje spinowe powracają do równowagi termicznej w procesie zwanym relaksacją spin-sieć . Szybkość przejścia od α do β jest proporcjonalna do populacji stanu α, P α i jest procesem pierwszego rzędu ze stałą szybkości W . Stan, w którym populacje spinowe są wyrównywane przez ciągłe promieniowanie RF ( P α = P β ) nazywa się nasyceniem i rezonans zanika, ponieważ prawdopodobieństwa przejścia zależą od różnicy populacji między poziomami energii.

W najprostszym przypadku, w którym NOE stosownych rezonanse dwóch Podziału 1 / 2 jąder, I, S, są chemicznie przesunięciem, ale nie j-sprzężone . Diagram energetyczny dla takiego układu ma cztery poziomy energetyczne, które zależą od stanów spinowych I i S odpowiadających odpowiednio αα, αβ, βα i ββ. W W” s jest prawdopodobieństwo na jednostkę czasu, który nastąpi przejście pomiędzy czterema poziomami energii, albo w innych warunkach szybkość, z których odpowiednie wirowanie koziołki występuje. Istnieją dwa pojedyncze przejścia kwantowe, W 1 I , odpowiadające αα ➞ αβ i βα ➞ ββ; W 1 S , odpowiadające αα ➞ βα i βα ➞ ββ; zerowe przejście kwantowe W 0 , odpowiadające βα ➞ αβ oraz podwójne przejście kwantowe odpowiadające αα ➞ ββ.

Podczas gdy promieniowanie o częstotliwości radiowej może indukować tylko pojedyncze przejścia kwantowe (ze względu na tak zwane zasady selekcji mechaniki kwantowej ), powodując powstanie obserwowalnych linii widmowych, relaksacja dipolarna może zachodzić dowolną ze ścieżek. Mechanizm dipolarny jest jedynym powszechnym mechanizmem relaksacji, który może powodować przejścia, w których odwraca się więcej niż jeden spin. W szczególności mechanizm relaksacji dipolarnej powoduje przejścia między stanami αα i ββ ( W 2 ) oraz między stanami αβ i βα ( W 0 ).

Wyrażony w kategoriach ich masowych namagnesowań NMR, doświadczalnie obserwowane NOE w stanie stacjonarnym dla jądra I, gdy rezonans jądra S jest nasycony ( ) jest określone wyrażeniem:

gdzie jest namagnesowanie (intensywność rezonansu) jądra w równowadze termicznej. Wyrażenie analityczne dla NOE można uzyskać, biorąc pod uwagę wszystkie ścieżki relaksacji i stosując równania Salomona, aby uzyskać

gdzie

i .

jest całkowitą szybkością podłużnej relaksacji dipolarnej ( ) spinu I spowodowanego obecnością spinu s , jest określana jako szybkość relaksacji krzyżowej i jest stosunkami magnetogirycznymi charakterystycznymi odpowiednio dla jąder i .

Nasycenie zdegenerowanych przejść W 1 S zaburza populacje równowagi tak, że P αα = P αβ i P βα = P ββ . Jednak ścieżki relaksacji systemu pozostają aktywne i działają w celu przywrócenia równowagi, z wyjątkiem tego, że przejścia W 1 S są nieistotne, ponieważ różnice populacji w tych przejściach są ustalane przez napromieniowanie RF, podczas gdy różnica populacji między przejściami W I nie nie zmieniają się od ich wartości równowagi. Oznacza to, że gdyby tylko pojedyncze przejścia kwantowe były aktywne jako ścieżki relaksacji, nasycenie rezonansu nie wpłynęłoby na intensywność rezonansu. Dlatego, aby zaobserwować NOE na intensywność rezonansu I, wkład i musi być ważny. Szlaki te, znane jako szlaki relaksacji krzyżowej , wnoszą znaczący wkład w relaksację spin-sieć tylko wtedy, gdy relaksacja jest zdominowana przez interakcje dipol-dipol lub sprzężenie skalarne, ale interakcja skalarna jest rzadko ważna i zakłada się, że jest nieistotna. W przypadku homojądrowym, gdzie , jeżeli dominującą ścieżką relaksacji jest , to nasycenie zwiększa intensywność rezonansu i NOE jest dodatnie , natomiast jeżeli jest dominującą ścieżką relaksacji , nasycenie zmniejsza intensywność rezonansu i NOE jest ujemne .

Ruch molekularny

To, czy NOE jest dodatni, czy ujemny, zależy wrażliwie od stopnia rotacyjnego ruchu molekularnego. Trzy dipolarne ścieżki relaksacji przyczyniają się w różnym stopniu do relaksacji spin-sieć w zależności od wielu czynników. Kluczowym jest to, że równowaga między ω 2 , ω 1 i ω 0 zależy w dużej mierze od czasu molekularnej korelacji rotacyjnej , , czyli czasu, w którym cząsteczka obraca się o jeden radian. NMR przedstawia teorię, że prawdopodobieństwo przejściowe związane i częstotliwości precesji Larmor , przez stosunkach:

gdzie to odległość dzieląca dwa spin- 12 jądra. Aby nastąpiła relaksacja, częstotliwość bębnów molekularnych musi odpowiadać częstotliwości Larmora jądra. W rozpuszczalnikach mobilnych ruch bębnów molekularnych jest znacznie szybszy niż . Tak zwana granica skrajnie zawężająca gdzie ). W tych warunkach relaksacja dwukwantowa W 2 jest bardziej efektywna niż W 1 lub W 0 , ponieważ τ c i 2ω 0 pasują lepiej niż τ c i ω 1 . Gdy ω 2 jest dominującym procesem relaksacji, wynik NOE jest dodatni.

Wyrażenie to pokazuje, że w przypadku homojądrowych gdzie I = S , w szczególności do 1 H NMR, maksymalna NOE, które mogą być obserwowane jest 1 \ 2, niezależnie od odległości od jąder. W przypadku heterojądrowym, gdzie IS , maksymalny NOE jest podany przez 1\2 ( γ S / γ I ), co podczas obserwacji heterojąder w warunkach szerokopasmowego odsprzęgania protonów może spowodować znaczną poprawę czułości. Najważniejszym przykładem w chemii organicznej jest obserwacja 13 C przy odsprzęganiu 1 H, co również powoduje nasycenie rezonansów 1 J. Wartość γ S / γ I jest bliska 4, co daje maksymalne wzmocnienie NOE o 200%, dając rezonanse 3 razy silniejsze, niż byłyby bez NOE. W wielu przypadkach atomy węgla mają przyłączony proton, co powoduje, że relaksacja jest zdominowana przez relaksację dipolarną, a NOE jest bliskie maksimum. Dla nieprotonowanych atomów węgla wzmocnienie NOE jest niewielkie, podczas gdy dla węgli, które rozluźniają się przez mechanizmy relaksacji przez inne niż interakcje dipol-dipol, wzmocnienie NOE może być znacznie zmniejszone. Jednym z powodów tego jest do stosowania deuteriated rozpuszczalniki (np CDCI 3 ) w 13 C NMR. Ponieważ deuter odpręża się w mechanizmie kwadrupolowym, nie ma ścieżek krzyżowej relaksacji, a NOE nie istnieje. Innym ważnym przypadkiem jest 15 N, przykład, w którym wartość jego stosunku magnetogirycznego jest ujemna. Często 15 N rezonanse są zredukowane lub NOE może rzeczywiście NULL się rezonans gdy 1 H jądra są oddzielone. Zwykle korzystne jest pobieranie takich widm technikami impulsowymi, które obejmują przeniesienie polaryzacji z protonów na 15 N, aby zminimalizować ujemny NOE.

Wyjaśnienie struktury

Pierwsze NOE zgłoszone przez Anet i Bourne

Podczas gdy związek NOE w stanie stacjonarnym z odległością międzyjądrową jest złożony, w zależności od szybkości relaksacji i ruchu molekularnego, w wielu przypadkach dla małych, szybko obracających się cząsteczek w skrajnie zawężonym limicie, półilościowa natura dodatnich NOE jest przydatna w wielu zastosowaniach strukturalnych. często w połączeniu z pomiarem stałych sprzężenia J. Na przykład, wzmocnienia NOE można zastosować do potwierdzenia przypisania rezonansu NMR, rozróżnienia izomerów strukturalnych, identyfikacji wzorów podstawienia pierścieni aromatycznych i konfiguracji podstawników alifatycznych oraz określenia preferencji konformacyjnych.

Niemniej jednak odległości międzyatomowe wyprowadzone z obserwowanego NOE mogą często pomóc w potwierdzeniu trójwymiarowej struktury cząsteczki. W tym zastosowaniu NOE różni się od zastosowania sprzężenia J tym, że NOE występuje w przestrzeni, a nie poprzez wiązania chemiczne. Zatem atomy znajdujące się blisko siebie mogą dawać NOE, podczas gdy sprzężenie spinowe obserwuje się tylko wtedy, gdy atomy są połączone 2–3 wiązaniami chemicznymi. Jednak zależność η I S (max) = 12 zaciemnia związek NOE z odległościami między jądrami, ponieważ dotyczy tylko wyidealizowanego przypadku, w którym relaksacja jest w 100% zdominowana przez oddziaływania dipol-dipol między dwoma jądrami I i S. W praktyce wartość ρ I zawiera wkłady innych konkurencyjnych mechanizmów, które służą jedynie zmniejszeniu wpływu W 0 i W 2 poprzez zwiększenie W 1 . Czasami, na przykład, relaksacja spowodowana oddziaływaniami elektronowo-jądrowymi z rozpuszczonym tlenem lub paramagnetycznymi jonami metali w rozpuszczalniku może uniemożliwić obserwację słabych wzmocnień NOE. Obserwowany NOE w obecności innych mechanizmów relaksacji jest wyrażony wzorem

gdzie ρ jest dodatkowym wkładem do całkowitej szybkości relaksacji z mechanizmów relaksacji nie obejmujących relaksacji krzyżowej. Stosując ten sam wyidealizowany model dwuspinowy dla relaksacji dipolarnej w skrajnym limicie zawężenia:

Łatwo to pokazać

Zatem dwuspinowy stan stacjonarny NOE zależy od odległości międzyjądrowej tylko wtedy, gdy występuje wpływ relaksacji zewnętrznej. Bell i Saunders wykazali, że zgodnie ze ścisłymi założeniami ρ c jest prawie stała dla podobnych cząsteczek w skrajnym limicie zawężenia. Dlatego biorąc stosunek wartości NOE w stanie ustalonym można uzyskać względne wartości odległości międzyjądrowej r . Chociaż eksperyment w stanie ustalonym jest przydatny w wielu przypadkach, może dostarczyć informacji jedynie o względnych odległościach międzyjądrowych. Z drugiej strony, początkowa szybkość , przy której rośnie NOE jest proporcjonalna do R JEST -6 , który zapewnia inne bardziej wyrafinowane alternatywy dla uzyskania informacji strukturalnej poprzez przemijających eksperymentów takich jak 2D-NOESY.

Dwuwymiarowy NMR

Sekwencja impulsów dla standardowego dwuwymiarowego eksperymentu NOESY
Widmo kodeiny 2D NOESY

Motywacje stosowania dwuwymiarowego NMR do pomiaru NOE są podobne jak w przypadku innych metod 2D. Maksymalną rozdzielczość poprawia rozłożenie dotkniętych rezonansów na dwa wymiary, dzięki czemu więcej pików jest rozdzielonych, można zaobserwować większe cząsteczki i więcej NOE można zaobserwować w jednym pomiarze. Co ważniejsze, gdy ruch molekularny jest w reżimie pośrednim lub spowolnionym, gdy NOE jest zerowy lub ujemny, eksperyment NOE w stanie stacjonarnym nie daje wyników, które można powiązać z odległościami międzyjądrowymi.

Cząsteczka kodeiny

Nuclear Overhauser Effect Spektroskopia (NOESY) to metoda spektroskopii 2D NMR stosowana do identyfikacji spinów jądrowych podlegających relaksacji krzyżowej i pomiaru ich szybkości relaksacji krzyżowej. Od 1 sprzęgła dipol-dipol H zapewnić podstawowe środki przekroju relaksacji dla cząsteczek organicznych w roztworze spinów przechodzi przekrój relaksacji bliskich siebie w przestrzeni. Dlatego piki poprzeczne widma NOESY wskazują, które protony są blisko siebie w przestrzeni. Pod tym względem eksperyment NOESY różni się od eksperymentu COSY, który opiera się na sprzęganiu J w celu zapewnienia korelacji spinowo-spinowej, i którego piki krzyżowe wskazują, które 1 H są zbliżone do których innych 1 H poprzez wiązania chemiczne cząsteczki.

Podstawowa sekwencja NOESY składa się z trzech impulsów 90°. Pierwszy impuls powoduje namagnesowanie spinu poprzecznego. Spiny precesują w czasie ewolucji t 1 , który jest zwiększany w trakcie eksperymentu 2D. Drugi impuls wytwarza namagnesowanie podłużne równe składowej magnetyzacji poprzecznej prostopadłej do kierunku impulsu. Ideą jest więc stworzenie warunków początkowych dla okresu mieszania τ m . W czasie mieszania NOE może mieć miejsce przeniesienie magnetyzacji poprzez relaksację krzyżową. Dla podstawowego eksperymentu NOESY, τ m jest utrzymywane na stałym poziomie przez cały eksperyment 2D, ale wybierane dla optymalnego tempa relaksacji krzyżowej i narastania NOE. Trzeci impuls wytwarza namagnesowanie poprzeczne z pozostałego namagnesowania podłużnego. Gromadzenie danych rozpoczyna się natychmiast po trzecim impulsem a namagnesowanie poprzeczny obserwuje się w zależności od czasu opóźnienia impulsu T 2 . Widmo NOESY generuje 2D Fouriera względem t 1 i T 2 . Przeprowadza się serię eksperymentów z wydłużaniem czasu mieszania i obserwuje się wzrost wzmocnienia NOE. Najbliższe protony wykazują najszybsze tempo narastania NOE.

Odległości międzyprotonowe można określić na podstawie jednoznacznie przypisanych, dobrze rozdzielonych widm NOESY o wysokim stosunku sygnału do szumu poprzez analizę intensywności pików krzyżowych. Można je uzyskać przez całkowanie objętości i przekształcić w szacunki odległości międzyprotonowych. Odległość między dwoma atomami i może być obliczona na podstawie objętości pików poprzecznych i stałej skalowania

gdzie można określić na podstawie pomiarów znanych stałych odległości. Zakres odległości może być podawany na podstawie znanych odległości i objętości w widmie, co daje średnią i odchylenie standardowe , pomiar wielu obszarów w widmie NOESY bez pików, tj. szum , oraz błąd pomiaru . Parametr jest ustawiony tak, aby wszystkie znane odległości mieściły się w granicach błędu. Pokazuje to, że można wyświetlić dolny zakres głośności NOESY

i że górna granica to:

Takie stałe odległości zależą od badanego systemu. Na przykład zablokowane kwasy nukleinowe mają wiele atomów, których odległość w cukrze różni się bardzo nieznacznie, co umożliwia oszacowanie kątów torsyjnych glikozydów, co umożliwiło NMR porównanie prognoz dynamiki molekularnej LNA. Jednak RNA mają cukry, które są znacznie bardziej elastyczne konformacyjnie i wymagają szerszych szacunków niskich i wysokich wiązań.

W charakteryzacji strukturalnej białek NOE są wykorzystywane do tworzenia ograniczeń odległości wewnątrzcząsteczkowych. W tej metodzie każda para protonów jest rozpatrywana oddzielnie, a intensywności pików krzyżowych NOESY są porównywane z referencyjnym pikiem krzyżowym z pary protonów o ustalonej odległości, takiej jak para protonów geminalno-metylenowych lub protony pierścieni aromatycznych. To proste podejście jest dość niewrażliwe na efekty dyfuzji spinowej lub niejednorodnych czasów korelacji i zwykle może prowadzić do określenia globalnego fałdu białka, pod warunkiem, że zidentyfikowano wystarczająco dużą liczbę NOE. Piki krzyżowe NOESY można sklasyfikować jako silne, średnie lub słabe i można je przełożyć na ograniczenia górnej odległości odpowiednio około 2,5, 3,5 i 5,0 Å. Takie ograniczenia można następnie wykorzystać w optymalizacji mechaniki molekularnej, aby uzyskać obraz konformacji stanu roztworu białka. Pełne określenie struktury opiera się na różnych eksperymentach NMR i metodach optymalizacji wykorzystujących zarówno przesunięcie chemiczne, jak i ograniczenia NOESY.

Heteronuklearny NOE



Niektóre metody eksperymentalne

Niektóre przykłady jedno- i dwuwymiarowych technik eksperymentalnych NMR wykorzystujących NOE obejmują:

  • NOESY, nuklearna spektroskopia Overhausera
  • HOESY, spektroskopia heterojądrowa z efektem Overhausera
  • ROESY, rotacyjna ramowa spektroskopia jądrowa z efektem Overhausera
  • TRNOE, przeniesiony jądrowy efekt Overhausera
  • DPFGSE-NOE, eksperyment podwójnego pulsacyjnego pola gradientowego z echem wirowym NOE

NOESY to określenie względnej orientacji atomów w cząsteczce, na przykład białku lub innej dużej cząsteczce biologicznej, tworzącej trójwymiarową strukturę. HOESY to korelacja krzyżowa NOESY pomiędzy atomami różnych pierwiastków. ROESY polega na blokowaniu spinu namagnesowania, aby zapobiec jego zerowi, stosowanym dla cząsteczek, dla których zwykłe NOESY nie ma zastosowania. TRNOE mierzy NOE między dwiema różnymi cząsteczkami oddziałującymi w tym samym roztworze, tak jak w przypadku wiązania liganda z białkiem. W eksperymencie DPFGSE-NOE, eksperyment przejściowy, który pozwala na stłumienie silnych sygnałów, a tym samym na wykrycie bardzo małych NOE.

Przykłady nuklearnego efektu Overhausera

Nuklearny efekt Overhausera

Rysunek (u góry) pokazuje, w jaki sposób spektroskopia jądrowa z efektem Overhausera może wyjaśnić strukturę przełączalnego związku. W tym przykładzie proton oznaczony jako {H} pokazuje dwa różne zestawy NOE w zależności od stanu izomeryzacji ( cis lub trans ) przełączalnych grup azowych . W stanie trans proton {H} jest daleki od grupy fenylowej pokazującej niebieskie NOE; podczas gdy stan cis utrzymuje proton {H} w pobliżu grupy fenylowej, co skutkuje pojawieniem się nowych NOE (pokazany na czerwono).

Innym przykładem (na dole), gdzie zastosowanie NOE jest przydatne do przypisania rezonansów i określenia konfiguracji, to polisacharydy. Na przykład złożone glukany posiadają wiele nakładających się sygnałów, zwłaszcza w widmie protonowym. Dlatego do przypisywania sygnałów korzystne jest wykorzystanie eksperymentów 2D NMR, w tym NOESY. Zobacz na przykład NOE węglowodanów .

Techniki homojądrowego NMR w badaniach węglowodanów.

Zobacz też

Bibliografia

Zewnętrzne linki