Fosfolipaza D - Phospholipase D

Fosfolipaza D ( EC 3.1.4.4 , lipofosfodiesteraza II , lecytynaza D , fosfataza cholinowa ) ( PLD ) jest enzymem z nadrodziny fosfolipaz . Fosfolipazy występują powszechnie i można je znaleźć w wielu organizmach, w tym w bakteriach, drożdżach, roślinach, zwierzętach i wirusach. Głównym substratem fosfolipazy D jest fosfatydylocholina , którą hydrolizuje, aby wytworzyć sygnałową cząsteczkę kwas fosfatydowy (PA) i rozpuszczalną cholinę w procesie zależnym od cholesterolu, zwanym prezentacją substratu . Rośliny zawierają liczne geny kodujące różne izoenzymy PLD o masie cząsteczkowej od 90 do 125 kDa . Komórki ssaków kodują dwie izoformy fosfolipazy D: PLD1 i PLD2 . Fosfolipaza D odgrywa ważną rolę w wielu procesach fizjologicznych , takich jak transport błonowy , reorganizacja cytoszkieletu , endocytoza za pośrednictwem receptorów , egzocytoza i migracja komórek . Dzięki tym procesom została dodatkowo zaangażowana w patofizjologię wielu chorób, w szczególności progresji choroby Parkinsona i Alzheimera , a także różnych nowotworów . PLD może również pomóc w ustaleniu progu wrażliwości na znieczulenie i siłę mechaniczną.

Odkrycie

Aktywność typu PLD została po raz pierwszy odnotowana w 1947 r. przez Donalda J. Hanahana i IL Chaikoffa. Jednak dopiero w 1975 roku wyjaśniono hydrolityczny mechanizm działania w komórkach ssaków . Roślinne izoformy PLD zostały najpierw oczyszczone z kapusty i rącznika pospolitego ; PLDα ostatecznie sklonowano i scharakteryzowano z różnych roślin, w tym ryżu, kukurydzy i pomidora. Roślinne PLD sklonowano w trzech izoformach: PLDα , PLDβ i PLDγ . Ponad pół wieku badań biochemicznych wskazywało na aktywność fosfolipazy D i PA w szerokim zakresie procesów fizjologicznych i chorób , w tym stanów zapalnych , cukrzycy , fagocytozy , sygnalizacji neuronalnej i sercowej oraz onkogenezy .

Funkcjonować

Ściśle mówiąc , fosfolipaza D jest transfosfatydylazą : pośredniczy w wymianie polarnych grup czołowych kowalencyjnie przyłączonych do lipidów związanych z błoną . Stosując wodę jako nukleofil , enzym ten katalizuje odszczepienie z wiązania fosfodiestrowe w strukturalnych fosfolipidy takie jak fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina . Produktami tej hydrolizy są związany z błoną lipidowy kwas fosfatydowy (PA) oraz cholina , która dyfunduje do cytozolu . Ponieważ cholina ma niewielką aktywność drugiego posłańca, aktywność PLD jest głównie przenoszona przez produkcję PA. PA jest silnie zaangażowany w transdukcję sygnału wewnątrzkomórkowego . Ponadto, niektórzy członkowie nadrodziny PLD mogą wykorzystywać pierwszorzędowe alkohole, takie jak etanol lub 1-butanol, do rozszczepiania fosfolipidu , skutecznie katalizując wymianę polarnej grupy czołowej lipidu . Inni członkowie tej rodziny są w stanie hydrolizować inne substraty fosfolipidowe, takie jak kardiolipina , a nawet wiązanie fosfodiestrowe stanowiące szkielet DNA .

Kwas fosfatydowy

W wielu funkcjach komórkowych fosfolipazy D pośredniczy jej główny produkt, kwas fosfatydowy (PA). PA to ujemnie naładowany fosfolipid , którego mała grupa głowy sprzyja skrzywieniu błony . Uważa się zatem, że ułatwia fuzję i rozszczepienie błony i pęcherzyków w sposób analogiczny do endocytozy za pośrednictwem klatryny . PA może również rekrutować białka, które zawierają odpowiednią domenę wiążącą , region charakteryzujący się regionami bogatymi w aminokwasy zasadowe . Dodatkowo PA może zostać przekształcony w wiele innych lipidów , takich jak kwas lizofosfatydowy (lizo-PA) lub diacyloglicerol , cząsteczki sygnałowe, które mają wiele wpływów na dalsze szlaki komórkowe . PA i jego pochodne lipidowe biorą udział w niezliczonych procesach , które obejmują wewnątrzkomórkowy transport pęcherzyków , endocytozę , egzocytozę , dynamikę cytoszkieletu aktynowego , różnicowanie proliferacji komórek i migrację .

Rycina 1. Model zależnej od ARF aktywacji fosfolipazy D i proponowany schemat endocytozy pęcherzykowej . W tym modelu ARF aktywuje fosfolipazę D ( PLD ), rekrutując ją do błony komórkowej . Hydroliza z fosfatydylocholiny ( PC ) przez ARF aktywowanej PLD produkuje kwas fosfatydowy ( PA ). PA następnie rekrutuje cząsteczek , które kształtują się wewnętrzną powierzchnię z dwuwarstwy lipidowej , co ułatwia tworzenie się pęcherzyka . Lokalna wzbogacenie kwaśnych fosfolipidy pomocy rekrut białek adapter ( AP ) i białek Coat ( CP ) do błony , inicjując w pączkowanie z pęcherzyka . W rozszczepieniu pęcherzyków ostatecznie pośredniczy dynamina , która sama w sobie jest efektorem PA.

PLD ssaków bezpośrednio oddziałuje z kinazami, takimi jak PKC , ERK , TYK i kontroluje sygnalizację wskazującą, że PLD jest aktywowana przez te kinazy. Ponieważ cholina jest bardzo obfita w komórce, aktywność PLD nie wpływa znacząco na poziom choliny i jest mało prawdopodobne, aby cholina odgrywała jakąkolwiek rolę w sygnalizacji.

Kwas fosfatydowy jest cząsteczką sygnałową i działa w celu rekrutacji SK1 do błon . PA jest niezwykle krótkotrwały i jest szybko hydrolizowany przez enzym fosfatazę fosfatydową do diacyloglicerolu (DAG). DAG może również zostać przekształcony w PA przez kinazę DAG . Chociaż PA i DAG są wzajemnie konwertowalne, nie działają na tych samych ścieżkach . Bodźce , które aktywują PLD nie aktywują enzymy downstream DAG i odwrotnie.

Możliwe, że chociaż PA i DAG są wzajemnie konwertowalne, można zachować oddzielne pule lipidów sygnalizujących i niesygnalizujących . Badania sugerują, że w sygnalizacji DAG pośredniczy wielonienasycony DAG, podczas gdy PA pochodzący z PLD jest jednonienasycony lub nasycony . Zatem funkcjonalny nasycony/jednonienasycony PA może zostać zdegradowany przez hydrolizę go z wytworzeniem niefunkcjonalnego nasyconego/jednonienasyconego DAG, podczas gdy funkcjonalny wielonienasycony DAG może zostać zdegradowany przez przekształcenie go w niefunkcjonalny wielonienasycony PA.

Lizofosfolipaza D zwana autotaksyną została niedawno zidentyfikowana jako odgrywająca ważną rolę w proliferacji komórek poprzez jej produkt, kwas lizofosfatydowy (LPA).

Struktura

PLD roślin i zwierząt mają spójną strukturę molekularną , charakteryzującą się miejscami katalizy otoczonymi szeregiem sekwencji regulatorowych . Miejsce aktywne z PLD składa się z czterech wysoce konserwowanych aminokwasów z kwasami sekwencji (I-IV), przy czym motywy II i IV są szczególnie zachowana. Te domeny strukturalne zawierają wyróżniającą sekwencję katalityczną HxKxxxxD (HKD), gdzie H , K i D to aminokwasy histydyna (H), lizyna (K), kwas asparaginowy (D), podczas gdy x oznacza aminokwasy niekonserwatywne . Te dwa motywy HKD nadają PLD aktywność hydrolityczną i są krytyczne dla jej aktywności enzymatycznej zarówno in vitro, jak i in vivo . Hydroliza z obligacji fosfodiestrowe występuje, gdy te sekwencje HKD są w prawidłowej odległości .

Białka ludzkie zawierające ten motyw to:

• PGS1 , PLD1 , PLD2 , PLD3 , PLD4 , PLD5

PC -hydrolyzing PLD jest homologiczna z kardiolipiny syntazy , fosfatydyloseryna syntazy , bakteryjnych PLD oraz białek wirusowych . Każdy z nich wydaje się posiadać duplikację domeny , co jest widoczne w obecności dwóch motywów HKD zawierających dobrze konserwowane reszty histydyny , lizyny i asparaginy , które mogą przyczyniać się do tworzenia centrum aktywnego kwasu asparaginowego . Escherichia coli endonukleaza (Nuc) i podobne białka wydają się być PLD homologi wykazują jednak tylko jeden z tych motywów.

PLD geny dodatkowo kodują wysoce konserwatywne regulacyjnych domen : the sekwencja phox konsensus (PX) The domeny homologiczne do plekstryny (PH), oraz miejsce wiązania dla fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PIP ₂ ).

Mechanizm katalizy

Zaproponowano, że hydroliza katalizowana PLD przebiega w dwóch etapach poprzez mechanizm „ ping-pong ”. W systemie tym, histydyny pozostałości każdy wzór HKD kolejno ataku z fosfolipidów podłoża . Funkcjonują jako nukleofile , że składnik imidazolu ugrupowania tych histydyny tworzą przejściowe wiązań kowalencyjnych z fosfolipidów , tworząc krótko pośrednim , który może być łatwo hydrolizowane przez wodę w następnym etapie .

Prezentacja podłoża ; PLD (niebieski owal) jest sekwestrowany w zależne od cholesterolu domeny lipidowe (zielone lipidy) przez palmitoilację . PLD wiąże również domeny PIP2 (czerwony sześciokąt) (szare zacienienie) zlokalizowane w nieuporządkowanym regionie komórki z fosfatydylocholiną (PC). Gdy PIP2 wzrasta w komórce, PLD przemieszcza się do PIP2, gdzie jest wystawiony na działanie i hydrolizuje PC do kwasu fosfatydowego (czerwony sferyczny lipid).

Mechanizm aktywacji

Prezentacja substratu W przypadku PLD2 ssaków molekularną podstawą aktywacji jest prezentacja substratu. Enzym pozostaje nieaktywny w mikrodomenach lipidowych bogatych w sfingomielinę i pozbawionych substratu PC. Zwiększony PIP2 lub spadek cholesterolu powoduje translokację enzymu do mikrodomeny PIP2 w pobliżu swojego substratu PC. Stąd PLD może być przede wszystkim aktywowana przez lokalizację w błonie komórkowej, a nie zmianę konformacyjną białka. Rozerwanie domen lipidowych przez środki znieczulające. lub siła mechaniczna. Białko może również ulegać zmianie konformacyjnej po związaniu PIP2, ale nie zostało to wykazane eksperymentalnie i stanowiłoby mechanizm aktywacji inny niż prezentacja substratu.

Izoformy

W komórkach ssaków zidentyfikowano dwie główne izoformy fosfolipazy D : PLD1 i PLD2 (53% homologii sekwencji ), z których każda jest kodowana przez odrębne geny . Wydaje się, że aktywność PLD występuje w większości typów komórek , z możliwymi wyjątkami leukocytów obwodowych i innych limfocytów . Obie izoformy PLD wymagają PIP ₂ jako kofaktor dla aktywności . PLD1 i PLD2 wykazują różne lokalizacje subkomórkowe, które zmieniają się dynamicznie w trakcie przekazywania sygnału . Aktywność PLD zaobserwowano w błonie komórkowej , cytozolu , ER i kompleksie Golgiego .

PLD1

PLD1 to białko o masie 120 kDa, które znajduje się głównie na wewnętrznych błonach komórek. Występuje głównie w kompleksie Golgiego , endosomach , lizosomach i ziarnistościach wydzielniczych . Po wiążące się z zewnątrzkomórkowej bodźca, PLD1 jest transportowana do błony komórkowej . Aktywność podstawowa PLD1 jest niska, jednak w celu transdukcji sygnału zewnątrzkomórkowego, to najpierw musi być aktywowany przez białka , takie jak Arf , Rho , Rac i kinazy białkowej C .

Rozporządzenie

Aktywność fosfolipazy D jest w dużym stopniu regulowana przez hormony , neuroprzekaźniki , lipidy , małe monomeryczne GTPazy i inne małe cząsteczki, które wiążą się z odpowiednimi domenami enzymu. W większości przypadków w przekazywaniu sygnału pośredniczy produkcja kwasu fosfatydowego , który pełni rolę wtórnego przekaźnika .

Specyficzne fosfolipidy są regulatorami aktywności PLD w komórkach roślinnych i zwierzęcych. Większość PLD wymagają fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforan (PIP ₂ ) jako kofaktorów aktywność. PIP ₂ i inne fosfoinozytydy są ważnymi modyfikatorami dynamiki cytoszkieletu i transportu przez błonę i mogą kierować PLD do swojego substratu PC. PLD regulowane przez te fosfolipidy są powszechnie zaangażowane w wewnątrzkomórkową transdukcję sygnału . Ich aktywność zależy od wiązania tych fosfoinozytydów w pobliżu miejsca aktywnego . U roślin i zwierząt, w tym miejsce wiążące charakteryzuje się obecnością konserwowanej sekwencji w podstawowych i aromatycznych aminokwasów . W roślinach takich jak Arabidopsis thaliana , to sekwencja składa się z RxxxxxKxR motywu wraz z odwróconego powtórzenia , w którym R oznacza argininę i K jest lizyna . Jego bliskość do miejsca aktywnego zapewnia wysoki poziom PLD1 i PLD2 działania i sprzyja translokacji z PLD1 do docelowych błon w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Domena C2

Wapń działa jako kofaktor w izoformach PLD zawierających domenę C2 . Wiązanie Ca2 ⁺ z domeną C2 prowadzi do zmian konformacyjnych enzymu, które wzmacniają wiązanie enzym-substrat , jednocześnie osłabiając asocjację z fosfoinozytydami . W niektórych roślin izoenzymów , takich jak PLDβ , Ca ²⁺ mogą wiązać się bezpośrednio z aktywnym miejscem pośrednio zwiększa jego powinowactwo do substratu przez wzmocnienie wiązania aktywatora PIP ₂ .

Domena PX

Uważa się, że sekwencja konsensusowa pbox (PX) pośredniczy w wiązaniu dodatkowych fosforanów fosfatydyloinozytolu, w szczególności 5-fosforanu fosfatydyloinozytolu (PtdIns5P), lipidu, który uważa się za niezbędny do endocytozy , może ułatwić reinternalizację PLD1 z błony plazmatycznej .

Domena PH

Wysoce konserwatywna domena homologii Pleckstrin (PH) jest domeną strukturalną o długości około 120 aminokwasów . Wiąże fosfatydyloinozytydy, takie jak fosfatydyloinozytol (3,4,5)-trisfosforan (PIP ₃ ) i fosfatydyloinozytol (4,5)-bisfosforan (PIP ₂ ). Może również wiązać heterotrimeryczne białka G poprzez ich podjednostkę βγ . Uważa się również, że wiązanie z tą domeną ułatwia ponowną internalizację białka poprzez zwiększenie jego powinowactwa do endocytotycznych tratw lipidowych .

Interakcje z małymi GTPasami

W komórkach zwierzęcych małe czynniki białkowe są ważnymi dodatkowymi regulatorami aktywności PLD. Te małe monomeryczne GTPazy są członkami tych Rho i ARF rodzin Ras nadrodziny . Niektóre z tych białek, takie jak Rac1 , Cdc42 i RhoA , allosterycznie aktywują ssaczą PLD1 , bezpośrednio zwiększając jej aktywność. W szczególności, przemieszczanie w cytozolu czynnika rybozylację ADP (ARF) w błonie jest niezbędna dla aktywacji PLD.

Role fizjologiczne i patofizjologiczne

Zatrucie alkoholem

Fosfolipaza D metabolizuje etanol do fosfatydyloetanolu (PEtOH) w procesie zwanym transfosfatydylacją. Wykorzystując genetykę much wykazano, że PEtOH pośredniczy w nadpobudliwej reakcji na alkohol u muszek owocowych. Wykazano, że poziom transfosfatydylacji etanolu jest podwyższony u alkoholików i członków ich rodzin. Ten mechanizm transfosfatydylacji etanolu pojawił się ostatnio jako alternatywna teoria wpływu alkoholu na kanały jonowe. Wiele kanałów jonowych jest regulowanych przez anionowe lipidy. uważa się, że współzawodnictwo PEtOH z endogennymi lipidami sygnalizacyjnymi pośredniczy w niektórych przypadkach we wpływie etanolu na kanały jonowe, a nie w bezpośrednim wiązaniu wolnego etanolu z kanałem.

Mechanosensacja

PLD2 jest mechanoczujnikiem i jest bezpośrednio wrażliwy na mechaniczne rozerwanie skupionych lipidów GM1. Rozerwanie mechaniczne (ścinanie płynu) następnie sygnalizuje komórce różnicowanie. PLD2 aktywuje również kanały TREK-1, kanał potasowy w szlaku przeciwbólowym.

W raku

Fosfolipaza D jest regulatorem kilku krytycznych procesów komórkowych, w tym transportu pęcherzyków , endocytozy , egzocytozy , migracji komórek i mitozy . Deregulacja tych procesów jest powszechna w karcynogenezie , a z kolei nieprawidłowości w ekspresji PLD powiązano z progresją kilku typów raka . W kilku złośliwych nowotworach piersi zaobserwowano mutację kierującą nadającą podwyższoną aktywność PLD2 . Podwyższona ekspresja PLD została również skorelowana z wielkością guza w raku jelita grubego , raku żołądka i raku nerki . Jednak szlaki molekularne, przez które PLD napędza progresję raka, pozostają niejasne. Jedna z potencjalnych hipotez wskazuje na kluczową rolę fosfolipazy D w aktywacji mTOR , supresora apoptozy komórek rakowych . Zdolność PLD do hamowania apoptozy w komórkach o podwyższonej aktywności kinazy tyrozynowej czyni ją kandydatem na onkogen w nowotworach, w których taka ekspresja jest typowa.

W chorobach neurodegeneracyjnych

Fosfolipazy D może również odgrywać ważną patofizjologii rolę w progresji od chorób neurodegeneracyjnych , głównie dzięki jego zdolności jako przetwornik sygnału w niezbędnych procesów komórkowych , takich jak reorganizacji cytoszkieletu i przemieszczaniu pęcherzyka . Wykazano, że rozregulowanie PLD przez białko α-synukleinę prowadzi do specyficznej utraty neuronów dopaminergicznych u ssaków . α-synukleina jest podstawowym składnikiem strukturalnym ciał Lewy'ego , agregatów białkowych, które są cechą charakterystyczną choroby Parkinsona . Odhamowanie PLD przez α-synukleinę może przyczyniać się do szkodliwego fenotypu choroby Parkinsona .

Nieprawidłowa aktywność PLD również podejrzewa się chorobę Alzheimera , gdzie stwierdzono interakcji z preseniliny 1 (PS-1), przy czym główny składnik z γ-sekretazy kompleks odpowiedzialny za enzymatyczne rozszczepienie z białka prekursorowego amyloidu (APP). Blaszki zewnątrzkomórkowe produktu β-amyloidu są cechą definiującą mózgi z chorobą Alzheimera . Wykazano, że działanie PLD1 na PS-1 wpływa na wewnątrzkomórkowy transport prekursora amyloidu do tego kompleksu . Fosfolipaza D3 (PLD3), nieklasyczny i słabo scharakteryzowany członek nadrodziny PLD , również została powiązana z patogenezą tej choroby.

Galeria

• 

  Fosfatydylocholina

• 

  Fosfatydat

• 

  Cholina

• 

  Miejsca rozszczepiania fosfolipazy

Bibliografia

Zewnętrzne linki

• Fosfolipaza+D w Narodowej Bibliotece Medycznej USA Medical Subject Headings (MeSH)