Rodzina GTPaz Rho - Rho family of GTPases
Rho rodziny GTP to rodzina małe (~ 21 kDa) sygnalizacji białka G i jest podrodziną Ras nadrodziny . Wykazano, że członkowie rodziny GTPazy Rho regulują wiele aspektów dynamiki wewnątrzkomórkowej aktyny i znajdują się we wszystkich królestwach eukariotycznych, w tym drożdżach i niektórych roślinach. Szczegółowo zbadano trzech członków rodziny: Cdc42 , Rac1 i RhoA . Wszystkie białka G są „przełącznikami molekularnymi”, a białka Rho odgrywają rolę w rozwoju organelli , dynamice cytoszkieletu , ruchu komórek i innych wspólnych funkcjach komórkowych.
Historia
Identyfikacja rodziny GTPaz Rho rozpoczęła się w połowie lat 80. XX wieku. Pierwszym zidentyfikowanym członkiem Rho był RhoA, wyizolowany przypadkowo w 1985 r. z mało rygorystycznych badań przesiewowych cDNA . Rac1 i Rac2 zostały zidentyfikowane później, w 1989, a następnie Cdc42 w 1990. Osiem dodatkowych ssaczych członków Rho zostało zidentyfikowanych na podstawie biologicznych badań przesiewowych do późnych lat 90-tych, co było punktem zwrotnym w biologii, gdzie dostępność pełnych sekwencji genomu pozwoliła na pełną identyfikację rodzin genów. Wszystkie komórki eukariotyczne zawierają GTPazę Rho (od 6 u drożdży do 20 u ssaków). U ssaków rodzina Rho składa się zatem z 20 członków rozmieszczonych w 8 podrodzinach: Rho, Rnd, RhoD/F, RhoH, Rac, Cdc42, RhoU/V i RhoBTB.
Już w 1990 r. Paterson i in. rozpoczął ekspresję aktywowanego białka Rho w szwajcarskich fibroblastach 3T3 .
W połowie lat 90. zaobserwowano, że białka Rho wpływają na tworzenie się wypustek komórkowych („procesów”) w fibroblastach. W artykule przeglądowym z 1998 r. Alan Hall zebrał dowody pokazujące, że nie tylko fibroblasty tworzą procesy po aktywacji Rho, ale praktycznie wszystkie komórki eukariotyczne.
Artykuł przeglądowy z 2006 roku autorstwa Bement et al. badali znaczenie przestrzennych stref aktywacji Rho.
Kategoryzacja
Rodzina GTPaz Rho należy do nadrodziny białek Ras , która składa się z ponad 150 odmian u ssaków. Białka Rho czasami oznaczają niektórych członków rodziny Rho ( RhoA , RhoB i RhoC ), a czasami odnoszą się do wszystkich członków rodziny. Ten artykuł dotyczy całej rodziny.
U ssaków rodzina Rho liczy 20 członków. Prawie wszystkie badania dotyczą trzech najczęstszych członków rodziny Rho: Cdc42, Rac1 i RhoA.
| członek rodziny Rho | Działanie na filamenty aktynowe |
|---|---|
| Cdc42 | wpływa na filopodia |
| Rac1 | wpływa na lamellipodia |
| RhoA | wpływa na włókna stresowe |
Tych 20 członków ssaków jest podzielonych na podrodzinę Rac (Rac1, Rac2, Rac3 i RhoG), podrodzinę Cdc42 (Cdc42, TC10/RhoQ, TCL/RhoJ), rodzinę RhoUV (RhoV/Chp i RhoU/Wrch-1/) , podrodzina RhoA (RhoA, RhoB i RhoC), podrodzina Rnd (Rnd1/Rho6, Rnd2/RhoN i Rnd3/RhoE), podrodzina RhoD (RhoD i RhoF/Rif), RhoBTB (RhoBTB1&2) i RhoH/TTF.
| Podklasa | Efekt cytoszkieletowy | Członkowie rodziny Rho |
|---|---|---|
| Podklasa Cdc42 | filopodia | Cdc42 |
| RhoQ (TC10) | ||
| RhoJ (TCL) | ||
| Podklasa RhoUV | filopodia i lamellipodia | RhoU (Wrch) |
| RhoV ( chp ) | ||
| Rac | lamellipodia | Rac1 |
| Rac2 | ||
| Rac3 | ||
| RhoG | ||
| RhoBTB | stabilność białka | RhoBTB1 |
| RhoBTB2 | ||
| RhoBTB3 | ||
| RhoH | Agonista Rac? | RhoH |
| Rho (podklasa) | ↑ włókna stresowe i ↑ zrosty ogniskowe | RhoA |
| RhoB | ||
| RhoC | ||
| Rnd | ↓ włókna stresowe i ↓ zrosty ogniskowe | Rnd1 |
| Rnd2 | ||
| Rnd3 (RhoE) | ||
| RhoF | Transport pęcherzyków , filopodia | RhoD |
| RhoF (Rif) |
Regulatorzy
Zidentyfikowano trzy ogólne klasy regulatorów sygnalizacji białkowej Rho: czynnik wymiany nukleotydów guaninowych (GEF) , białka aktywujące GTPazę (GAP) i inhibitory dysocjacji nukleotydów guaninowych (GDI) . GEF aktywują białka Rho poprzez katalizowanie wymiany GDP na GTP. GAP kontrolują zdolność GTPazy do hydrolizy GTP do GDP , kontrolując naturalną szybkość ruchu od konformacji aktywnej do konformacji nieaktywnej. Białka GDI tworzą duży kompleks z białkiem Rho, pomagając zapobiegać dyfuzji w obrębie błony i do cytozolu, działając w ten sposób jako kotwica i umożliwiając ścisłą kontrolę przestrzenną aktywacji Rho. U ludzi 82 GEF (71 Dbl-podobnych i 11 DOCK-podobnych) pozytywnie kontroluje aktywność członków Rho, podczas gdy 66 białek GAP kontroluje ją ujemnie.
Ostatnie prace ujawniły ważne dodatkowe mechanizmy regulacyjne: mikroRNA regulują posttranskrypcyjne przetwarzanie mRNA kodujących GTPazę Rho; palmitoilacja i ukierunkowanie jądrowe wpływają na dystrybucję wewnątrzkomórkową; fosforylacja potranslacyjna, transglutaminacja i AMPylacja modulują sygnalizację GTPazy Rho; a ubikwitynacja kontroluje stabilność i obrót białka GTPazy Rho. Te tryby regulacji zwiększają złożoność sieci sygnalizacyjnej GTPazy Rho i umożliwiają precyzyjną kontrolę czasoprzestrzenną poszczególnych GTPaz Rho.
Efektory
Każde białko Rho wpływa na liczne białka w dół, z których wszystkie odgrywają role w różnych procesach komórkowych. Znaleziono ponad 60 celów z trzech powszechnych GTPaz Rho. Dwie cząsteczki, które bezpośrednio stymulują polimeryzację aktyny, to białka Arp2/3 i forminy związane z diafanem.
| GTPaza | Efektor |
|---|---|
| RhoA | Cit , Cnksr1 , Diaph1 , Diaph2 , DgkQ , FlnA , KcnA2 , Ktn1 , Rtkn1 , Rtkn2 , Rhpn1 , Rhpn2 , Itpr1 , PlcG1 , PI-5-P5K , Pld1 , Pkn1 , Pkn2 , Rock1 , Rock2 , PrkcA , Ppp1r12A |
| Rac1 | Sra1 , IRSp53 , PAK1 , PAK2 , PAK3 |
| Cdc42 | Białko zespołu Wiskotta-Aldricha , N- WASP , IRSp53 , Dia2 , Dia3 , ROCK1 , ROCK2 , PAK4 |
Funkcje
Białka Rho/Rac biorą udział w wielu różnych funkcjach komórkowych, takich jak polarność komórki, ruch pęcherzykowy, cykl komórkowy i dynamika transkrypcji.
Morfologia
Komórki zwierzęce przybierają różne kształty w zależności od ich funkcji i umiejscowienia w ciele. Białka Rho pomagają komórkom regulować zmiany kształtu przez cały cykl życia. Zanim komórki będą mogły przejść kluczowe procesy, takie jak pączkowanie, mitoza lub lokomocja, muszą mieć pewien rodzaj polaryzacji komórek .
Jednym z przykładów roli Rho GTPas w polaryzacji komórki jest obserwowany w szeroko zbadanej komórce drożdży. Zanim komórka będzie mogła pączkować, Cdc42 jest używany do zlokalizowania regionu błony komórkowej, który zacznie wybrzuszać się w nowej komórce. Kiedy Cdc42 jest usuwany z komórki, narośl nadal się tworzą, ale robią to w sposób niezorganizowany.
Jedną z najbardziej oczywistych zmian w morfologii komórki kontrolowanej przez białka Rho jest tworzenie się lamellipodiów i filopodiów , wykształcających procesy, które wyglądają jak „palce” lub „stopy” i często napędzają komórki lub stożki wzrostu przez powierzchnie. Praktycznie wszystkie komórki eukariotyczne tworzą takie procesy po aktywacji Rho. Fibroblasty, takie jak szwajcarskie komórki 3T3, są często wykorzystywane do badania tych zjawisk.
Techniki nauki
Wiele z tego, co wiadomo o zmianach morfologii komórkowej i skutkach białek Rho, pochodzi z tworzenia konstytutywnie aktywnej zmutowanej formy białka. Mutacja kluczowego aminokwasu może zmienić konformację całego białka, powodując jego trwałe przyjęcie konformacji, która przypomina stan związany z GTP. Białko to nie może być normalnie dezaktywowane poprzez hydrolizę GTP i dlatego jest „utknięte”. Gdy aktywowane w ten sposób białko Rho ulega ekspresji w komórkach 3T3, następują zmiany morfologiczne, takie jak skurcze i tworzenie filopodiów.
Ponieważ białka Rho są białkami G i są związane z błoną plazmatyczną, ich lokalizację można łatwo kontrolować. W każdej sytuacji, niezależnie od tego, czy chodzi o gojenie ran, cytokinezę , czy pączkowanie , można zobrazować i zidentyfikować lokalizację aktywacji Rho. Na przykład, jeśli okrągły otwór zostanie wykonany w kulistej komórce, Cdc42 i inne aktywne Rhos są widoczne w największym stężeniu wokół obwodu okrągłego uszkodzenia. Jedną z metod utrzymywania przestrzennych stref aktywacji jest zakotwiczenie w cytoszkielecie aktynowym, zapobiegając dyfuzji białka związanego z błoną z obszaru, w którym jest najbardziej potrzebne. Inną metodą konserwacji jest tworzenie dużego kompleksu, który jest odporny na dyfuzję i sztywniej związany z membraną niż sam Rho.
Ruch
Oprócz tworzenia lamellipodiów i filopodiów, koncentracja wewnątrzkomórkowa i przenikanie się różnych białek Rho napędza rozszerzenia i skurcze, które powodują lokomocję komórek. Sakumura i in. zaproponował model oparty na równaniach różniczkowych, który pomaga wyjaśnić aktywność białek Rho i ich związek z ruchem. Model ten obejmował trzy białka Cdc42, RhoA i Rac. Założono, że Cdc42 sprzyja wydłużeniu filopodiów i blokowej depolimeryzacji aktyny. Uznano, że RhoA zachęca do cofania aktyny. Rac traktowano w celu pobudzenia wydłużania lamellipodiów, ale zablokowania depolimeryzacji aktyny. Te trzy białka, choć znacznie uproszczone, obejmowały kluczowe etapy lokomocji komórkowej. Dzięki różnym technikom matematycznym znaleziono rozwiązania równań różniczkowych opisujących różne obszary aktywności w oparciu o aktywność wewnątrzkomórkową. Artykuł kończy się wykazaniem, że model przewiduje, że istnieje kilka stężeń progowych, które wywołują interesujące skutki dla aktywności komórki. Poniżej pewnej koncentracji aktywność jest bardzo mała, nie powodując wydłużenia ramion i stóp komórki. Powyżej pewnego stężenia białko Rho powoduje drgania sinusoidalne, podobnie jak rozszerzenia i skurcze lamellipodiów i filopodiów. Zasadniczo model ten przewiduje, że zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia tych trzech kluczowych aktywnych białek Rho powoduje pozafazową aktywność komórki, co skutkuje rozszerzeniami i skurczami, które również są poza fazą.
Gojenie się ran
Jednym z przykładów zachowania modulowanego przez białka Rho GTPazy jest gojenie się ran. Rany goją się inaczej u młodych kurcząt i dorosłych kurcząt. U młodych piskląt rany goją się poprzez skurcz, podobnie jak sznurek ściągający do zamykania worka. U starszych kurczaków komórki pełzają po ranie podczas poruszania się. Tworzenie aktyny wymaganej do zamykania ran u młodych piskląt jest kontrolowane przez białka Rho GTPaza, ponieważ po wstrzyknięciu egzoenzymu bakteryjnego stosowanego do blokowania aktywności rho i rac, polimery aktyny nie tworzą się, a zatem gojenie całkowicie zanika.
Polaryzacja komórki
Badania na fibroblastach wskazują na dodatnie sprzężenie zwrotne między aktywnością Cdc42 a wypływem H+ przez izoformę 1 wymieniacza Na-H (NHE1) na przedniej krawędzi migrujących komórek. Wypływ H+ za pośrednictwem NHE1 jest wymagany do wiązania GTP katalizowanego przez guaninowy czynnik wymiany (GEF) z Cdc42, co sugeruje mechanizm regulacji polarności przez tę małą GTPazę w migrujących komórkach.
Fagocytoza
Innym zachowaniem komórkowym, na które wpływają białka rho, jest fagocytoza. Podobnie jak w przypadku większości innych rodzajów modulacji błony komórkowej, fagocytoza wymaga cytoszkieletu aktynowego, aby pochłonąć inne elementy. Filamenty aktynowe kontrolują tworzenie fagocytarnego kubka, a aktywne Rac1 i Cdc42 są zaangażowane w tę kaskadę sygnalizacyjną.
Mitoza
Jeszcze innym ważnym aspektem zachowania komórkowego, który, jak się uważa, obejmuje sygnalizację przez białko rho, jest mitoza . Chociaż przez lata uważano, że aktywność GTPazy rho jest ograniczona do polimeryzacji aktyny, a zatem do cytokinezy , która występuje po mitozie, pojawiły się nowe dowody, które wykazują pewną aktywność w tworzeniu mikrotubul i samym procesie mitozy. Ten temat jest wciąż dyskutowany i istnieją dowody zarówno za, jak i przeciw na znaczenie rho w mitozie.
Aplikacje
Regeneracja układu nerwowego
Ze względu na ich wpływ na ruchliwość i kształt komórek, białka Rho stały się wyraźnym celem w badaniach stożków wzrostu, które tworzą się podczas generowania i regeneracji aksonów w układzie nerwowym. Białka Rho mogą być potencjalnym celem dostarczania do uszkodzeń rdzenia kręgowego po urazie. Po uszkodzeniu rdzenia kręgowego przestrzeń zewnątrzkomórkowa staje się hamująca dla naturalnych wysiłków neuronów w celu regeneracji.
Te naturalne wysiłki obejmują tworzenie stożka wzrostu na proksymalnym końcu uszkodzonego aksonu. Nowo utworzone szyszki wzrostowe następnie próbują „pełzać” w poprzek zmiany. Są wrażliwe na sygnały chemiczne w środowisku pozakomórkowym. Jedna z wielu wskazówek hamujących obejmuje proteoglikany siarczanu chondroityny (CSPG). Neurony rosnące w hodowli stają się bardziej zdolne do przekraczania regionów podłoża pokrytego CSPG po ekspresji konstytutywnie aktywnego Cdc42 lub Rac1 lub ekspresji dominującej formy negatywnej (inhibicji) RhoA. Wynika to częściowo z powodu egzogennych białek Rho napędzających lokomocję komórek pomimo sygnałów zewnątrzkomórkowych promujących apoptozę i zapadanie się stożka wzrostu. Modulacja wewnątrzkomórkowa białek Rho stała się zatem przedmiotem zainteresowania w badaniach mających na celu regenerację rdzenia kręgowego.
Upośledzenie intelektualne
Dysfunkcja białek Rho została również powiązana z niepełnosprawnością intelektualną . Niepełnosprawność intelektualna w niektórych przypadkach wiąże się z wadami rozwojowymi kolców dendrytycznych , które tworzą postsynaptyczne połączenia między neuronami . Zniekształcone kolce dendrytyczne mogą wynikać z modulacji sygnalizacji białka rho. Po sklonowaniu różnych genów zaangażowanych w upośledzenie umysłowe sprzężone z chromosomem X zidentyfikowano trzy geny, które mają wpływ na sygnalizację Rho, w tym oligofreninę-1 (białko GAP, które stymuluje aktywność GTPazy Rac1, Cdc42 i RhoA), PAK3 (zaangażowany w wpływ Rac i Cdc42 na cytoszkielet aktynowy) i αPIX (GEF, który pomaga aktywować Rac1 i Cdc42). Ze względu na wpływ sygnalizacji Rho na cytoszkielet aktynowy, genetyczne awarie białka rho mogą wyjaśniać nieregularną morfologię dendrytów neuronalnych obserwowaną w niektórych przypadkach upośledzenia umysłowego.
Rak
Po odkryciu, że białka Ras są zmutowane w 30% ludzkich nowotworów, podejrzewano, że zmutowane białka Rho mogą również brać udział w rozmnażaniu się raka. Jednak od sierpnia 2007 r. nie znaleziono mutacji onkogennych w białkach Rho, a tylko jedna została zmieniona genetycznie. Aby wyjaśnić rolę szlaków Rho bez mutacji, naukowcy zwrócili się teraz po odpowiedzi do regulatorów aktywności rho i poziomów ekspresji białek Rho.
Jednym ze sposobów wyjaśnienia zmienionej sygnalizacji przy braku mutacji jest zwiększona ekspresja. W wielu typach raka wykazano nadekspresję RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, Rac2, Rac3, RhoE, RhoG, RhoH i Cdc42. Ta zwiększona obecność tak wielu cząsteczek sygnałowych oznacza, że białka te promują funkcje komórkowe, które stają się nadmiernie aktywne w komórkach rakowych.
Drugim celem wyjaśniającym rolę białek Rho w nowotworach są ich białka regulatorowe. Białka Rho są bardzo ściśle kontrolowane przez wiele różnych źródeł i zidentyfikowano ponad 60 aktywatorów i 70 inaktywatorów. Wykazano, że wiele GAP, GDI i GEF podlega nadekspresji, regulacji w dół lub mutacji w różnych typach raka. Gdy sygnał w górę zostanie zmieniony, aktywność jego celów w dół – tj. białek Rho – zmieni się w aktywności.
Ellenbroek i in. przedstawił szereg różnych efektów aktywacji Rho w komórkach rakowych. Po pierwsze, podczas inicjacji nowotworu modyfikacja aktywności Rho może hamować apoptozę, a zatem przyczyniać się do długowieczności sztucznych komórek. Po stłumieniu naturalnej apoptozy można zaobserwować nieprawidłowy wzrost guza poprzez utratę polarności, w której integralną rolę odgrywają białka Rho. Następnie rosnąca masa może zaatakować swoje normalne granice poprzez zmianę białek adhezyjnych potencjalnie powodowanych przez białka Rho. Wreszcie, po zahamowaniu apoptozy, polaryzacji komórek i cząsteczek adhezyjnych, masa rakowa może swobodnie tworzyć przerzuty i rozprzestrzeniać się na inne obszary ciała.
Bibliografia
W sekwencjonowaniu nowotworów na dużą skalę zidentyfikowano kilka mutacji w białkach Rho. Mutacje te są wymienione w bazie danych Catalog of Somatic Mutations ( http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/ ). Funkcjonalne konsekwencje tych mutacji są nieznane.
