Sondy lantanowe - Lanthanide probes
Sondy lantanowe są nieinwazyjnym narzędziem analitycznym powszechnie używanym do zastosowań biologicznych i chemicznych . Lantanowce to jony metali, które mają wypełniony poziom energii 4f i ogólnie odnoszą się do pierwiastków cer do lutetu w układzie okresowym pierwiastków . Fluorescencji soli lantanowców są słabe, ponieważ pochłanianie energii jonem metalicznym jest mała; stąd najczęściej stosowane są chelatowane kompleksy lantanowców. Termin chelat pochodzi od greckiego słowa oznaczającego „pazur” i jest stosowany do nazywania ligandów, które łączą się z jonem metalu z dwoma lub więcej atomami donorów poprzez wiązania celownikowe. Fluorescencja jest najbardziej intensywna, gdy jon metalu ma stopień utlenienia 3+. Nie wszystkie metale lantanowce mogą być użyte, a najczęstsze to: Sm(III), Eu(III), Tb(III) i Dy(III).
Historia
Od wczesnych lat 30. wiadomo, że sole niektórych lantanowców są fluorescencyjne. Reakcja soli lantanowców z kwasami nukleinowymi była omawiana w wielu publikacjach w latach 30. i 40. XX wieku, w których do utrwalania struktur kwasów nukleinowych stosowano odczynniki zawierające lantan. W 1942 roku odkryto, że kompleksy europu , terbu i samaru wykazują niezwykłe właściwości luminescencyjne po wzbudzeniu światłem UV . Jednak pierwsze barwienie komórek biologicznych lantanowcami nastąpiło dwadzieścia lat później, gdy rozmazy bakterii E. coli potraktowano wodnymi roztworami kompleksu europu, które przy oświetleniu lampą rtęciową pojawiły się jako jaskrawoczerwone plamki. Uwaga na sondy lantanowe znacznie wzrosła w połowie lat 70., kiedy fińscy naukowcy zaproponowali poliaminokarboksylany Eu(III), Sm(III), Tb(III) i Dy(III) jako czujniki luminescencyjne w immunotestach luminescencyjnych czasowo-rozdzielczych (TRL). Optymalizacja metod analitycznych od lat 70. XX wieku dla chelatów lantanowców i mikroskopii luminescencyjnej czasowo-rozdzielczej (TRLM) zaowocowała zastosowaniem sond lantanowców w wielu dziedzinach nauki, medycyny i handlu.
Techniki
Istnieją dwie główne techniki oznaczania: heterogeniczna i homogeniczna. Jeżeli do analizy stosuje się dwa chelaty lantanowców jeden po drugim – nazywa się to testowaniem heterogenicznym. Pierwszy analit jest połączony ze specyficznym środkiem wiążącym na stałym nośniku, takim jak polimer, a następna reakcja łączy pierwszy słabo luminescencyjny kompleks lantanowców z nowym, lepszym. Ta żmudna metoda jest stosowana, ponieważ drugi bardziej luminescencyjny związek nie wiązałby się bez obecności pierwszego analitu. Późniejsza detekcja czasowo-rozdzielcza sondy luminescencyjnej z centrum metalu daje pożądany sygnał. Antygeny , steroidy i hormony są rutynowo oznaczane technikami heterogenicznymi. Testy homogeniczne polegają na bezpośrednim sprzężeniu znacznika lantanowca z akceptorem organicznym.
Relaksacja stanów wzbudzonych cząsteczek często zachodzi poprzez emisję światła, która nazywana jest fluorescencją. Istnieją dwa sposoby pomiaru tego emitowanego promieniowania: w funkcji częstotliwości (odwrotność do długości fali ) lub czasu. Konwencjonalnie widmo fluorescencji pokazuje intensywność fluorescencji przy różnych długościach fali, ale ponieważ lantanowce mają stosunkowo długie czasy zaniku fluorescencji (od jednej mikrosekundy do jednej milisekundy), możliwe jest rejestrowanie emisji fluorescencji w różnych czasach zaniku z danej energii wzbudzenia przy czas zero. Nazywa się to spektroskopią fluorescencyjną w czasie.
Mechanizm
Lantanowce mogą być stosowane, ponieważ ich mały rozmiar ( promień jonowy ) daje im zdolność zastępowania jonów metali w kompleksach białkowych, takich jak wapń czy nikiel . Właściwości optyczne, takie jak jony lantanowców Ln (III) i pochodzą ze szczególnych cech ich elektronicznej [Xe] 4f n konfiguracjach. Te konfiguracje generują wiele poziomów elektronowych, których liczbę podaje [14!/n!(14-n)!], co przekłada się na 3003 poziomy energetyczne dla Eu(III) i Tb(III).
Energie tych poziomów są dobrze zdefiniowane ze względu na ekranowanie orbitali 4f przez wypełnione podpowłoki 5s i 5p i nie są zbyt wrażliwe na środowiska chemiczne, w które wprowadzane są jony lantanowców. Przejścia 4f-4f w powłoce wewnętrznej obejmują zakresy widzialne i bliskie podczerwieni. Są ostre i łatwo rozpoznawalne. Ponieważ te przejścia są zabronione przez parzystość, czas życia stanów wzbudzonych jest długi, co pozwala na zastosowanie spektroskopii czasowo-rozdzielczej , ostatecznego atutu w badaniach biologicznych i mikroskopii. Jedyną wadą przejść ff jest ich słaba siła oscylatora, która w rzeczywistości może być zamieniona w zaletę.
Energia pochłonięta przez receptor organiczny (ligand) jest przenoszona na stany wzbudzone Ln(III), a ostre pasma emisji pochodzące od jonu metalu są wykrywane po szybkiej konwersji wewnętrznej do poziomu emitującego. Zjawisko to nazywa się uczuleniem kompleksu z centralnym metalem (nazywanym również efektem antenowym) i jest dość złożone. Ścieżka migracji energii przechodzi jednak przez długowieczny stan tripletowy liganda. Jony Ln(III) są dobrymi wygaszaczami stanów tripletowych, dzięki czemu fotowybielanie jest znacznie zmniejszone. Trzy rodzaje przejść obserwowanych dla sond lantanowych to: LMCT, 4f-5d i wewnątrzkonfiguracyjne 4f-4f. Pierwsze dwa występują zwykle przy energiach zbyt wysokich, aby mogły być stosowane w bioaplikacjach.
Aplikacje
Badania nad rakiem
Narzędzia do badań przesiewowych do opracowywania nowych terapii przeciwnowotworowych są bardzo poszukiwane na całym świecie i często wymagają określenia kinetyki enzymów. Wysoka czułość luminescencji lantanowców, zwłaszcza luminescencji rozdzielczej w czasie, okazała się idealnym kandydatem do tego celu. Istnieje kilka sposobów przeprowadzenia tej analizy przy użyciu fluorogennych substratów enzymatycznych, substratów zawierających grupy donorowe/akceptorowe umożliwiające transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) oraz testy immunologiczne. Na przykład, białka wiążące nukleotydy guaninowe składają się z kilku podjednostek, z których jedna obejmuje te z podrodziny Ras . GTPazy Ras działają jak przełączniki binarne, przekształcając trifosforan guadenozyny ( GTP ) w difosforan guadenozyny ( GDP ). Luminescencja kompleksu Tb(III) z norfloksacyną jest wrażliwa na określenie stężenia fosforanu uwalnianego przez transformację GTP do GDP.
sondy pH
Protonowanie miejsc zasadowych w układach zawierających chromofor i centrum luminescencyjnego metalu prowadzi do powstania czujników pH. Niektóre początkowo proponowane układy były oparte na pochodnych pirydyny, ale nie były one trwałe w wodzie. Zaproponowano bardziej wytrzymałe czujniki, w których rdzeń jest podstawionym makrocyklem, zwykle zawierającym grupy koordynujące fosfinianowe , karboksylanowe lub cztery amidowe . Zaobserwowano, że emisja sondy luminescencyjnej lantanowca wzrasta około sześciokrotnie przy obniżeniu pH roztworu z sześciu do dwóch.
Czujnik nadtlenku wodoru
Nadtlenek wodoru można wykryć z dużą czułością za pomocą luminescencji sond lantanowców – jednak tylko przy stosunkowo wysokich wartościach pH. Procedurę analityczną opartą na lantanowcach zaproponowano w 2002 roku w oparciu o odkrycie, że kompleks europu z różnymi tetracyklinami wiąże nadtlenek wodoru, tworząc luminescencyjny kompleks.
Szacowanie rozmiaru cząsteczki i odległości atomów
FRET w sondach lantanowców jest szeroko stosowaną techniką pomiaru odległości między dwoma punktami oddzielonymi około 15-100 Angstremów. Pomiary można wykonywać w warunkach fizjologicznych in vitro za pomocą genetycznie kodowanych barwników, a często także in vivo. Technika ta polega na zależnym od odległości transferze energii z fluoroforu donorowego do barwnika akceptorowego. Sondy lantanowe były używane do badania interakcji DNA-białko (przy użyciu kompleksu chelatu terbu ) w celu pomiaru odległości w kompleksach DNA zgiętych przez białko CAP.
Konformacja białka
Sondy lantanowe były używane do wykrywania zmian konformacyjnych w białkach. Ostatnio za pomocą tej techniki zmierzono kanał jonów potasowych Shakera, kanał bramkowany napięciem zaangażowany w impulsy nerwowe. Niektórzy naukowcy wykorzystali również transfer energii rezonansu luminescencji (LRET) oparty na lantanowcach, który jest bardzo podobny do FRET, do badania zmian konformacyjnych w polimerazie RNA po wiązaniu z DNA i inicjacji transkrypcji u prokariontów. LRET wykorzystano również do zbadania interakcji białek dystrofiny i aktyny w komórkach mięśniowych. Dystrofina jest obecna w wewnętrznej błonie komórek mięśniowych i uważa się, że stabilizuje włókna mięśniowe poprzez wiązanie z włóknami aktynowymi. Zastosowano specyficznie wyznakowaną dystrofinę ze znakowanymi przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi Tb.
Wirusologia
Tradycyjne procedury diagnostyczne wirusów są zastępowane czułymi testami immunologicznymi z lantanowcami. Technika oparta na fluorescencji czasowo-rozdzielczej ma ogólne zastosowanie, a jej działanie zostało również przetestowane w oznaczeniu antygenów wirusowych w próbkach klinicznych.
Obrazowanie medyczne
Zaproponowano kilka systemów, które łączą zdolność MRI z sondami lantanowców w podwójnych testach. Sonda luminescencyjna może na przykład służyć do lokalizacji środka kontrastowego MRI. Pomogło to w wizualizacji dostarczania kwasów nukleinowych do hodowanych komórek. Lantanowce nie są używane ze względu na ich fluorescencję, ale ich właściwości magnetyczne.
Biologia - interakcje receptor-ligand
Sondy lantanowe wykazują unikalne właściwości fluorescencyjne, w tym długi czas życia fluorescencji, duże przesunięcie Stokesa i wąski pik emisji. Właściwości te są bardzo korzystne przy opracowywaniu sond analitycznych do oddziaływań receptor-ligand. Opracowano wiele badań fluorescencyjnych opartych na lantanowcach dla GPCR , w tym CXCR1 , insulinopodobny receptor peptydowy 2 , receptor aktywowany proteazą 2 , receptor β2-adrenergiczny i receptor C3a .
Oprzyrządowanie
Emitowane fotony z wzbudzonych lantanowców są wykrywane przez wysoce czułe urządzenia i techniki, takie jak detekcja pojedynczych fotonów. Jeśli czas życia wzbudzonego poziomu emitującego jest wystarczająco długi, do zwiększenia stosunku sygnału do szumu można zastosować detekcję czasowo-rozdzielczą (TRD). Oprzyrządowanie używane do wykonywania LRET jest stosunkowo proste, choć nieco bardziej złożone niż konwencjonalne fluorymetry. Ogólne wymagania to impulsowe źródło wzbudzenia UV i detekcja czasowo-rozdzielcza.
Źródła światła emitujące krótkotrwałe impulsy można podzielić na następujące kategorie:
- Lampy błyskowe
- Lampy wyładowcze z cięciem mechanicznym lub elektronicznym
- Iskierniki
- Lasery impulsowe
Najważniejszymi czynnikami przy doborze impulsowego źródła światła są czas trwania i natężenie światła. Lasery impulsowe dla zakresu od 300 do 500 nm zastąpiły obecnie iskierniki w spektroskopii fluorescencyjnej. Stosowane są cztery ogólne typy laserów pulsacyjnych: lasery z impulsowym wzbudzeniem, lasery z przełączaniem G, lasery z blokadą trybu i lasery z wyrzutem wnękowym. Impulsowe lasery azotowe (337 nm) były często używane jako źródło wzbudzenia we fluorometrii czasowo-rozdzielczej.
We fluorometrii czasowo-rozdzielczej szybka fotopowielacz jest jedynym praktycznym detektorem pojedynczych fotonów. Dobra rozdzielczość pojedynczego fotonu jest również zaletą w zliczaniu fotonów z sond fluorescencyjnych o długim rozpadzie, takich jak chelaty lantanowców.
Te komercyjne przyrządy są obecnie dostępne na rynku: fluorometr z mikrofiltrem Perkin-Elmer LS-2, spektrometr luminescencyjny Perkin-Elmer model LS 5 oraz fluorometr czasowo-rozdzielczy LKB-Wallac model 1230.
Ligandy
Ligandy sond lantanowców muszą spełniać kilka wymagań chemicznych, aby sondy działały prawidłowo. Te cechy to: rozpuszczalność w wodzie, duża stabilność termodynamiczna przy fizjologicznych pH , obojętność kinetyczna i absorpcja powyżej 330 nm, aby zminimalizować niszczenie żywych materiałów biologicznych.
Chelaty, które zostały zbadane i stosowane do tej pory, można podzielić na następujące grupy:
- Chelaty Tris (trzy ligandy)
- Chelaty Tetrakis (cztery ligandy)
- Mieszane kompleksy ligandowe
- Kompleksy z neutralnymi dawcami
- Inne takie jak: kompleksy ftalanów , pikrynianów i salicylanów .
Wydajność transferu energii z ligandu do jonu jest określona wiązaniem ligand-metal. Transfer energii jest bardziej wydajny w przypadku wiązania kowalencyjnego niż w przypadku wiązania jonowego. Podstawniki w ligandzie, które są elektronodonorami, takie jak grupy hydroksylowe , metoksylowe i metylowe , zwiększają fluorescencję. Odwrotny efekt jest widoczny, gdy przyłączona jest grupa odciągająca elektrony (taka jak nitro). Ponadto intensywność fluorescencji zwiększa się przez podstawienie ligandu fluorem. Transfer energii do jonu metalu wzrasta, ponieważ elektroujemność grupy fluorowanej sprawia, że wiązanie europ-tlen ma bardziej kowalencyjny charakter. Wykazano, że zwiększona koniugacja przez podstawniki aromatyczne przez zastąpienie fenylu grupami naftylowymi zwiększa fluorescencję.