Hydroksylaza fenyloalaniny - Phenylalanine hydroxylase
Hydroksylaza fenyloalaniny ( WWA ) ( EC 1.14.16.1 ) jest enzymem , który katalizuje hydroksylację aromatycznego łańcucha bocznego fenyloalaniny w celu wytworzenia tyrozyny . PAH jest jednym z trzech członków hydroksylaz aminokwasów aromatycznych zależnych od biopteryny , klasy monooksygenazy, która do katalizy wykorzystuje tetrahydrobiopterynę (BH 4 , kofaktor pterydynowy ) i żelazo niehemowe. Podczas reakcji, tlen cząsteczkowy heterolytically przecięto sekwencyjnego wprowadzania jednego atomu tlenu w BH 4 i podłożem fenyloalaniny. U ludzi mutacje w jego genie kodującym PAH mogą prowadzić do zaburzenia metabolicznego fenyloketonurii .
Mechanizm enzymatyczny
Uważa się, że reakcja przebiega przez następujące etapy:
- tworzenie kompleksu Fe (II) -OO-BH 4 mostu.
- heterolityczne rozszczepienie wiązania OO z wytworzeniem ferroksy okso hydroksylującego związku pośredniego Fe(IV)=O
- atak na Fe(IV)=O w celu hydroksylacji substratu fenyloalaniny do tyrozyny.
Tworzenie i rozszczepianie mostka żelazowo-peroksypterynowego. Chociaż silne dowody obsługuje Fe (IV) = O jako hydroksylowanie pośredniej mechanistyczne dane bazowe powstawania Fe (II) -OO-BH 4 mostu przed heterolitycznego rozszczepiania pozostaje kontrowersyjny. Zaproponowano dwa szlaki w oparciu o modele, które różnią się bliskością żelaza do kofaktora pteryny oraz liczbą cząsteczek wody, które, jak się zakłada, są skoordynowane z żelazem podczas katalizy. Zgodnie z jednym modelem, początkowo tworzy się i stabilizuje kompleks żelaza dwutlenowego jako hybryda rezonansowa Fe 2+ O 2 i Fe 3+ O 2 − . Aktywowany O 2 następnie atakuje BH 4 , tworząc stan przejściowy charakteryzujący się separacją ładunku między pierścieniem pterynowym z niedoborem elektronów i bogatymi w elektrony formami ditlenowymi. Fe (II), -OO-BH 4 mostu jest następnie formowane. Z drugiej strony, tworzenie tego mostka zostało zamodelowane przy założeniu, że BH4 znajduje się w pierwszej powłoce koordynacyjnej żelaza i że żelazo nie jest skoordynowane z żadną cząsteczką wody. Model ten przewiduje inny mechanizm obejmujący rodnik pteryny i ponadtlenek jako krytyczne związki pośrednie. Gdy jest on utworzony, kompleks Fe (II), -OO-BH 4 mostu jest podzielona przez heterolitycznego rozszczepienie wiązania OO do Fe (IV) = O i 4a-hydroxytetrahydrobiopterin; zatem tlen cząsteczkowy jest źródłem obu atomów tlenu stosowanych do hydroksylacji pierścienia pteryny i fenyloalaniny.
Hydroksylacja fenyloalaniny przez półprodukt okso ferrylowy. Ponieważ mechanizm wiąże się z Fe (IV) = O (w przeciwieństwie do peroxypterin) hydroksylowanie pośredni utlenianie BH 4 kofaktor i hydroksylacji fenyloalaniny można oddzielić, w wyniku bezproduktywnego zużycia BH4 i tworzenia H2O2. Jednak gdy produkt jest produktywny, związek pośredni Fe(IV)=O jest dodawany do fenyloalaniny w elektrofilowej reakcji podstawienia aromatycznego, która redukuje żelazo ze stanu żelazowego do stanu żelaznego. Chociaż początkowo zaproponowano tlenek arenu lub rodnik pośredni, analizy pokrewnych hydroksylaz tryptofanowych i tyrozynowych sugerują, że zamiast tego reakcja przebiega przez kationowy związek pośredni, który wymaga skoordynowania Fe(IV)=O z ligandem wodnym, a nie z grupą hydrokso. . Ten kationowy związek pośredni następnie ulega przesunięciu 1,2-wodorkiem NIH, dając dienonowy związek pośredni, który następnie ulega tautomeryzacji z wytworzeniem produktu tyrozynowego. Kofaktor pteryny jest regenerowany przez uwodnienie produktu karbinolaminowego WWA do chinonoidowej dihydrobiopteryny (qBH 2 ), która jest następnie redukowana do BH 4 .
Regulacja enzymatyczna
W PAH proponuje się wykorzystanie modelu regulacji allosterycznej morfeeinowej .
Ssacze PAH istnieje w równowadze składającej się z tetramerów o dwóch różnych architekturach, z jedną lub większą liczbą form dimerycznych jako części równowagi. To zachowanie jest zgodne z mechanizmem dysocjacyjnym allosterycznym.
Wiele badań sugeruje, że PAH ssaków wykazuje zachowanie porównywalne z syntazą porfobilinogenu (PBGS), przy czym doniesiono, że różne czynniki, takie jak pH i wiązanie ligandu, wpływają na aktywność enzymu i stabilność białka.
Struktura
Monomer PAH (51,9 kDa) składa się z trzech odrębnych domen: regulatorowej domeny N-końcowej (reszty 1–117) zawierającej subdomenę ACT wiążącą Phe, domeny katalitycznej (reszty 118–427) i domeny C-końcowej (reszty 428–453) odpowiedzialne za oligomeryzację identycznych monomerów. Przeprowadzono obszerną analizę krystalograficzną, zwłaszcza domeny katalitycznej skoordynowanej z pteryną i żelazem, aby zbadać miejsce aktywne. Określono również strukturę N-końcowej domeny regulatorowej i wraz z rozwiązaną strukturą homologicznej domeny tetrameryzacji C-końcowej hydroksylazy tyrozynowej zaproponowano model strukturalny tetramerycznego PAH. Za pomocą krystalografii rentgenowskiej określono eksperymentalnie strukturę WWA szczura pełnej długości i wykazała ona postać enzymu w stanie samohamownym lub w stanie spoczynku. Postać w stanie spoczynku (RS-PAH) różni się architektonicznie od postaci aktywowanej (A-PAH). Obecnie brakuje pełnej długości struktury A-PAH, ale wyznaczono charakterystyczny dla A-PAH interfejs ACT-ACT ze stabilizacją Phe i zaproponowano strukturalny model A-PAH oparty na analizie SAXS.
Domena katalityczna
Rozwiązane struktury krystaliczne domeny katalitycznej wskazują, że miejsce aktywne składa się z otwartej i przestronnej kieszeni wyłożonej głównie resztami hydrofobowymi, chociaż obecne są również trzy reszty kwasu glutaminowego, dwie histydyny i tyrozyna, które wiążą żelazo. Istnieją sprzeczne dowody dotyczące stanu koordynacji atomu żelaza i jego bliskości do BH4 w miejscu aktywnym. Zgodnie z analizą krystalograficzną, Fe(II) jest koordynowany przez wodę, His285, His290 i Glu330 (układ triady twarzy 2-his-1-karboksylan) z geometrią oktaedryczną. Włączenie analogu Phe do struktury krystalicznej zmienia zarówno żelazo ze stanu sześcio- do pięciokoordynacyjnego, włączając pojedynczą cząsteczkę wody i koordynację dwukleszczową do Glu330 i otwierając miejsce wiązania tlenu. BH4 jest jednocześnie przesunięty w kierunku atomu żelaza, chociaż kofaktor pteryny pozostaje w drugiej sferze koordynacyjnej. Z drugiej strony konkurencyjny model oparty na NMR i analizach modelowania molekularnego sugeruje, że wszystkie skoordynowane cząsteczki wody są wypychane z miejsca aktywnego podczas cyklu katalitycznego, podczas gdy BH4 staje się bezpośrednio skoordynowany z żelazem. Jak omówiono powyżej, rozwiązanie tej rozbieżności będzie ważne dla określenia dokładnego mechanizmu katalizy PAH.
N-końcowa domena regulacyjna
Regulacyjny charakter domeny N-końcowej (reszty 1–117) wynika z jej elastyczności strukturalnej. Analiza wymiany wodoru/deuteru wskazuje, że allosteryczne wiązanie Phe globalnie zmienia konformację WWA tak, że miejsce aktywne jest mniej okludowane, ponieważ granica między domenami regulatorową i katalityczną jest coraz bardziej wystawiona na działanie rozpuszczalnika. Ta obserwacja jest zgodna z badaniami kinetycznymi, które wykazują początkowo niską szybkość tworzenia tyrozyny dla PAH pełnej długości. Tego czasu opóźnienia nie obserwuje się jednak dla skróconego PAH bez domeny N-końcowej lub jeśli enzym o pełnej długości jest wstępnie inkubowany z Phe. Delecja domeny N-końcowej eliminuje również czas opóźnienia, zwiększając prawie dwukrotnie powinowactwo do Phe; Nie obserwuje się różnicy V max lub K m dla kofaktora tetrahydrobiopteryny. Dodatkowe regulacje zapewnia Ser16; fosforylacja tej reszty nie zmienia konformacji enzymu, ale zmniejsza stężenie Phe wymagane do aktywacji allosterycznej. Ta N-końcowa domena regulatorowa nie jest obserwowana w bakteryjnych PAH, ale wykazuje znaczną homologię strukturalną z domeną regulatorową dehydrogenazy fosfoglicerynianowej, enzymu w szlaku biosyntezy seryny.
Domena tetrameryzacji
Prokariotyczne PAH jest monomeryczne, podczas gdy eukariotyczne PAH istnieje w równowadze między formami homotetramerycznymi i homodimerycznymi. Interfejs dimeryzacji składa się z pętli związanych z symetrią, które łączą identyczne monomery, podczas gdy nakładająca się C-końcowa domena tetrameryzacji pośredniczy w połączeniu konformacyjnie odmiennych dimerów, które charakteryzują się różną względną orientacją domen katalitycznej i tetrameryzacji (Flatmark, Erlandsen). Wynikające z tego zniekształcenie symetrii tetrameru jest widoczne w zróżnicowanym polu powierzchni interfejsów dimeryzacji i odróżnia WWA od tetramerycznie symetrycznej hydroksylazy tyrozynowej. Zaproponowano mechanizm zamiany domen, aby pośredniczyć w tworzeniu tetrameru z dimerów, w którym alfa-helisy C-końcowe wzajemnie zmieniają swoją konformację wokół elastycznego regionu zawiasowego z pięcioma resztami C-końcowymi, tworząc strukturę zwoju, przesuwając równowagę w kierunku postaci tetramerycznej. Chociaż zarówno homodimeryczna, jak i homotetrameryczna postać WWA są katalitycznie aktywne, obie wykazują zróżnicowaną kinetykę i regulację. Oprócz zmniejszonej wydajności katalitycznej, dimer nie wykazuje pozytywnej współpracy w stosunku do L-Phe (który w wysokich stężeniach aktywuje enzym), co sugeruje, że L-Phe allosterycznie reguluje PAH poprzez wpływ na oddziaływanie dimer-dimer.
Funkcja biologiczna
PAH jest kluczowym enzymem w metabolizmie fenyloalaniny i katalizuje etap ograniczający tempo jej całkowitego katabolizmu do dwutlenku węgla i wody. Regulacja przepływu przez szlaki związane z fenyloalaniną ma kluczowe znaczenie w metabolizmie ssaków, o czym świadczy toksyczność wysokich poziomów tego aminokwasu w osoczu obserwowana w fenyloketonurii (patrz poniżej). Głównym źródłem fenyloalaniny są spożywane białka, ale stosunkowo niewielka część tej puli jest wykorzystywana do syntezy białek. Zamiast tego większość spożytej fenyloalaniny jest katabolizowana przez WWA z wytworzeniem tyrozyny ; dodanie grupy hydroksylowej pozwala na rozerwanie pierścienia benzenowego w kolejnych etapach katabolicznych. Transaminacja do fenylopirogronianu , którego metabolity są wydalane z moczem, stanowi inną drogę przemiany fenyloalaniny, ale dominuje katabolizm poprzez PAH.
U ludzi enzym ten ulega ekspresji zarówno w wątrobie, jak i nerkach, i istnieją pewne przesłanki wskazujące na to, że może być różnie regulowany w tych tkankach. PAH jest niezwykły wśród hydroksylaz aminokwasów aromatycznych ze względu na jego udział w katabolizmie; Z drugiej strony hydroksylazy tyrozyny i tryptofanu ulegają ekspresji głównie w ośrodkowym układzie nerwowym i katalizują etapy ograniczające szybkość biosyntezy neuroprzekaźników/hormonów.
Znaczenie choroby
Niedobór aktywności PAH z powodu mutacji w PAH powoduje hiperfenyloalaninemię (HPA), a gdy poziom fenyloalaniny we krwi wzrasta powyżej 20-krotności normalnego stężenia, dochodzi do choroby metabolicznej fenyloketonurii (PKU). PKU jest heterogenna zarówno genotypowo, jak i fenotypowo: Zidentyfikowano ponad 300 różnych wariantów patogennych, z których większość odpowiada mutacjom zmiany sensu, które mapują domenę katalityczną. Gdy kohorta zidentyfikowanych mutantów PAH ulegała ekspresji w układach rekombinowanych, enzymy wykazywały zmienione zachowanie kinetyczne i/lub zmniejszoną stabilność, zgodnie z mapowaniem strukturalnym tych mutacji zarówno do domeny katalitycznej, jak i tetrameryzacji enzymu. BH4 4 podawano jako leczenie farmakologiczne i wykazano, że obniża poziom fenyloalaniny we krwi w segmencie pacjentów z PKU, których genotypy prowadzą do pewnej resztkowej aktywności PAH, ale nie wykazują defektu w syntezie lub regeneracji BH4 4 . Dalsze badania sugerują, że w przypadku niektórych mutantów PAH nadmiar BH4 4 działa jako farmakologiczny chaperon stabilizujący zmutowane enzymy z zaburzonym tworzeniem tetramerów i zwiększoną wrażliwością na rozszczepienie proteolityczne i agregację. Mutacje, które zostały zidentyfikowane w locus PAH są udokumentowane w Phenylalanine Hydroxylase Locus Knowledgbase (PAHdb, https://web.archive.org/web/20130718162051/http://www.pahdb.mcgill.ca/ ).
Ponieważ fenyloketonuria może powodować nieodwracalne uszkodzenia, konieczne jest określenie niedoborów hydroksylazy fenyloalaniny na wczesnym etapie rozwoju. Pierwotnie przeprowadzono to za pomocą testu hamowania bakterii znanego jako Test Guthrie . Obecnie PKU jest częścią badań przesiewowych noworodków w wielu krajach, a podwyższone poziomy fenyloalaniny są identyfikowane wkrótce po urodzeniu za pomocą pomiaru za pomocą tandemowej spektrometrii masowej . Umieszczenie osoby na diecie o niskiej zawartości fenyloalaniny i wysokiej zawartości tyrozyny może pomóc w zapobieganiu wszelkim długotrwałym uszkodzeniom w ich rozwoju.
Powiązane enzymy
Hydroksylaza fenyloalaniny jest blisko spokrewniona z dwoma innymi enzymami:
- hydroksylaza tryptofanu (numer EC 1.14.16.4), która kontroluje poziom serotoniny w mózgu i przewodzie pokarmowym
- hydroksylaza tyrozynowa (numer EC 1.14.16.2), która kontroluje poziomy dopaminy , epinefryny i norepinefryny w mózgu i rdzeniu nadnerczy.
Te trzy enzymy są homologiczne, to znaczy uważa się, że wyewoluowały z tej samej starożytnej hydroksylazy.
Bibliografia
Dalsza lektura
- Eisensmith RC, Woo SL (1993). „Molekularne podstawy fenyloketonurii i pokrewnych hiperfenyloalaninemii: mutacje i polimorfizmy w ludzkim genie hydroksylazy fenyloalaniny”. Mutacja ludzka . 1 (1): 13–23. doi : 10.1002/humu.1380010104 . PMID 1301187 . S2CID 19476605 .
- Konecki DS, Lichter-Konecki U (sierpień 1991). „Locus fenyloketonurii: aktualna wiedza na temat alleli i mutacji genu hydroksylazy fenyloalaniny w różnych populacjach”. Genetyka człowieka . 87 (4): 377–88. doi : 10.1007/BF00197152 . PMID 1679029 . S2CID 25627287 .
- Bawełna RG (1991). „Heterogeniczność fenyloketonurii na poziomie klinicznym, białka i DNA”. Czasopismo Dziedzicznej Choroby Metabolicznej . 13 (5): 739–50. doi : 10.1007/BF01799577 . PMID 2246858 . S2CID 21931016 .
- Erlandsen H, Fusetti F, Martinez A, Hough E, Flatmark T, Stevens RC (grudzień 1997). „Struktura krystaliczna domeny katalitycznej ludzkiej hydroksylazy fenyloalaniny ujawnia strukturalne podstawy fenyloketonurii”. Biologia strukturalna przyrody . 4 (12): 995–1000. doi : 10.1038/nsb1297-995 . PMID 9406548 . S2CID 6293946 .
- Waters PJ, mgr Parniak, Nowacki P, Scriver CR (1998). „Analiza ekspresji in vitro mutacji w hydroksylazie fenyloalaniny: łączenie genotypu z fenotypem i struktury z funkcją”. Mutacja ludzka . 11 (1): 4-17. doi : 10.1002/(SICI)1098-1004(1998)11:1<4::AID-HUMU2>3,0.CO;2-L . PMID 9450897 .
- Waters PJ (kwiecień 2003). „W jaki sposób mutacje genu PAH powodują hiper-fenyloalaninemię i dlaczego mechanizm ma znaczenie: spostrzeżenia z ekspresji in vitro” . Mutacja ludzka . 21 (4): 357–69. doi : 10.1002/humu.10197 . PMID 12655545 . S2CID 23769500 .
Zewnętrzne linki
- GeneReviews / NCBI / NIH / UW wpis dotyczący niedoboru hydroksylazy fenyloalaniny
- Specyficzna dla locus baza danych wariantów ludzkiego genu hydroksylazy fenyloalaniny
- Cząsteczka miesiąca: hydroksylaza fenyloalaniny
- Przegląd wszystkich informacji strukturalnych dostępnych w PDB dla UniProt : P00439 (Human fenyloalaniny hydroksylaza) w PDBe-KB .
