Wyciszanie RNA - RNA silencing
Wyciszanie RNA lub interferencja RNA odnosi się do rodziny efektów wyciszania genów, przez które ekspresja genów jest ujemnie regulowana przez niekodujące RNA, takie jak mikroRNA . Wyciszanie RNA można również zdefiniować jako specyficzną dla sekwencji regulację ekspresji genów wyzwalaną przez dwuniciowy RNA ( dsRNA ). Mechanizmy wyciszania RNA są wysoce konserwatywne u większości eukariontów . Najbardziej powszechnym i dobrze zbadanym przykładem jest interferencja RNA ( RNAi ) , w której ulegający endogennej ekspresji mikroRNA ( miRNA ) lub egzogennie wyprowadzony mały interferujący RNA ( siRNA ) indukuje degradację komplementarnego RNA informacyjnego . Zidentyfikowano inne klasy małych RNA, w tym RNA oddziałujące z piwi ( piRNA ) i jego podgatunki powtarzają związane z nim małe interferujące RNA ( rasiRNA ).
Tło
Wyciszanie RNA opisuje kilka powiązanych mechanistycznie ścieżek, które są zaangażowane w kontrolę i regulację ekspresji genów. Szlaki wyciszania RNA są związane z aktywnością regulacyjną małych niekodujących RNA (o długości około 20-30 nukleotydów), które działają jako czynniki zaangażowane w inaktywację sekwencji homologicznych, promowanie aktywności endonukleaz, zatrzymanie translacji i/lub modyfikację chromatyczną lub DNA. W kontekście, w którym zjawisko to było badane po raz pierwszy, odkryto, że małe RNA odgrywa ważną rolę w obronie roślin przed wirusami. Na przykład, badania te wykazały, że enzymy wykrywają dwuniciowe RNA ( dsRNA ) normalnie nie występujące w komórkach i trawią je na małe kawałki, które nie są w stanie wywołać choroby.
Podczas gdy niektóre funkcje wyciszania RNA i jego maszynerii są zrozumiałe, wiele nie jest. Na przykład wykazano, że wyciszanie RNA jest ważne w regulacji rozwoju i kontroli zdarzeń transpozycji. Wykazano, że wyciszanie RNA odgrywa rolę w ochronie przeciwwirusowej zarówno roślin, jak i owadów. Również u drożdży wykazano, że wyciszanie RNA utrzymuje strukturę heterochromatyny. Jednak zróżnicowana i zniuansowana rola wyciszania RNA w regulacji ekspresji genów pozostaje przedmiotem ciągłych badań naukowych. Zaproponowano szereg różnorodnych funkcji dla rosnącej liczby scharakteryzowanych małych sekwencji RNA – np. regulacja rozwoju, losu komórek nerwowych, śmierci komórki, proliferacji, magazynowania tłuszczu, losu komórek krwiotwórczych, wydzielania insuliny.
Wyciszanie RNA działa poprzez hamowanie translacji lub cięcie informacyjnego RNA ( mRNA ), w zależności od stopnia komplementarności parowania zasad. RNA został szeroko zbadany pod kątem jego roli jako pośrednika w translacji genów na białka. Jednak bardziej aktywne funkcje regulacyjne zaczęto zajmować się dopiero pod koniec lat 90. XX wieku. Przełomowe badanie zapewniające zrozumienie pierwszego zidentyfikowanego mechanizmu zostało opublikowane w 1998 r. przez Fire i wsp., wykazując, że dwuniciowe RNA może działać jako wyzwalacz wyciszania genów. Od tego czasu zidentyfikowano i scharakteryzowano różne inne klasy wyciszania RNA. Obecnie potencjał terapeutyczny tych odkryć jest badany m.in. w kontekście celowanej terapii genowej.
Chociaż wyciszanie RNA jest ewoluującą klasą mechanizmów, wspólnym tematem jest fundamentalna zależność między małymi RNA a ekspresją genów. Zaobserwowano również, że główne obecnie zidentyfikowane szlaki wyciszania RNA mają mechanizmy działania, które mogą obejmować zarówno potranskrypcyjne wyciszanie genów (PTGS), jak i zależne od chromatyny wyciszanie genów (CDGS). CDGS obejmuje składanie małych kompleksów RNA na powstających transkryptach i jest uważana za obejmującą mechanizmy działania, które implikują zdarzenia wyciszania genów transkrypcyjnych (TGS) i kotranskrypcyjnego wyciszania genów (CTGS). Jest to istotne przynajmniej dlatego, że dowody sugerują, że małe RNA odgrywają rolę w modulacji struktury chromatyny i TGS.
Pomimo wczesnego skupienia się w literaturze na interferencji RNA ( RNAi ) jako podstawowego mechanizmu, który występuje na poziomie translacji informacyjnego RNA, od tego czasu zidentyfikowano inne w szerszej rodzinie konserwatywnych szlaków wyciszania RNA działających na poziomie DNA i chromatyny. Wyciszanie RNA odnosi się do aktywności wyciszania szeregu małych RNA i jest ogólnie uważane za szerszą kategorię niż RNAi. Chociaż terminy są czasami używane zamiennie w literaturze, RNAi jest ogólnie uważany za gałąź wyciszania RNA. W zakresie, w jakim przydatne jest rozróżnienie między tymi pokrewnymi koncepcjami, wyciszanie RNA można traktować jako odniesienie do szerszego schematu kontroli związanych z małym RNA zaangażowanych w ekspresję genów i ochronę genomu przed ruchomymi, powtarzającymi się sekwencjami DNA, retroelementami, i transpozony w zakresie, w jakim mogą one indukować mutacje. Mechanizmy molekularne wyciszania RNA początkowo badano na roślinach, ale od tego czasu rozszerzono je na różne tematy, od grzybów po ssaki, dostarczając mocnych dowodów na to, że szlaki te są wysoce konserwatywne.
Obecnie zidentyfikowano co najmniej trzy podstawowe klasy małego RNA, a mianowicie: mały interferujący RNA ( siRNA ), mikroRNA ( miRNA ) i RNA oddziałujący z piwi ( piRNA ).
małe interferujące RNA (siRNA)
siRNA działają w jądrze i cytoplazmie i biorą udział w RNAi oraz CDGS. siRNA pochodzą z długich prekursorów dsRNA pochodzących z różnych prekursorów jednoniciowego RNA (ssRNA), takich jak sensowne i antysensowne RNA. siRNA również pochodzą z RNA o strukturze spinki do włosów pochodzących z transkrypcji regionów o odwróconych powtórzeniach. siRNA mogą również powstawać enzymatycznie z niekodujących prekursorów RNA. Obszerna jest literatura na temat siRNA w ramach RNAi.
mikroRNA (miRNA)
Większość miRNA działa w cytoplazmie i pośredniczy w degradacji mRNA lub zatrzymaniu translacji. Wykazano jednak, że niektóre miRNA roślinne działają bezpośrednio, promując metylację DNA. miRNA pochodzą z prekursorów spinki do włosów generowanych przez enzymy RNazy III Drosha i Dicer . Zarówno miRNA, jak i siRNA tworzą albo indukowany RNA kompleks wyciszający ( RISC ), albo jądrową formę RISC, znaną jako kompleks wyciszający transkrypcję indukowany przez RNA ( RITS ). Obszerna jest literatura na temat miRNA w ramach RNAi.
Trzy główne nieulegające translacji regiony i mikroRNA
Trzy główne nieulegające translacji regiony (3'UTR) informacyjnego RNA (mRNA) często zawierają sekwencje regulatorowe, które po transkrypcji powodują interferencję RNA. Takie 3'-UTR często zawierają zarówno miejsca wiązania mikroRNA (miRNA), jak i białek regulatorowych. Wiążąc się ze specyficznymi miejscami w obrębie 3'-UTR, miRNA mogą zmniejszać ekspresję genów różnych mRNA poprzez hamowanie translacji lub bezpośrednie powodowanie degradacji transkryptu. 3'-UTR może również mieć regiony tłumiące, które wiążą białka represorowe, które hamują ekspresję mRNA.
3'-UTR często zawiera elementy odpowiedzi mikroRNA (MRE) . MRE to sekwencje, z którymi wiążą się miRNA. Są to dominujące motywy w 3'-UTR. Spośród wszystkich motywów regulatorowych w obrębie 3'-UTR (np. obejmujących regiony tłumiące), MRE stanowią około połowę motywów.
Od 2014 r. strona internetowa miRBase , archiwum sekwencji i adnotacji miRNA , zawierała 28 645 wpisów w 233 gatunkach biologicznych. Spośród nich 1881 miRNA znajdowało się w oznaczonych ludzkich loci miRNA. Przewidywano, że miRNA mają średnio około czterystu docelowych mRNA (wpływających na ekspresję kilkuset genów). Freidman i in. szacują, że >45 000 miejsc docelowych miRNA w ludzkich 3'UTR mRNA jest konserwowanych powyżej poziomów tła, a >60% genów kodujących ludzkie białka znajduje się pod presją selekcyjną, aby utrzymać parowanie z miRNA.
Bezpośrednie eksperymenty pokazują, że pojedynczy miRNA może zmniejszyć stabilność setek unikalnych mRNA. Inne eksperymenty pokazują, że pojedyncze miRNA może hamować produkcję setek białek, ale ta represja często jest stosunkowo łagodna (mniej niż 2-krotna).
Skutki dysregulacji ekspresji genów miRNA wydają się istotne w przypadku raka. Na przykład w nowotworach przewodu pokarmowego zidentyfikowano dziewięć miRNA jako zmienionych epigenetycznie i skutecznych w zmniejszaniu aktywności enzymów naprawczych DNA.
Skutki rozregulowania ekspresji genów przez miRNA wydają się również mieć znaczenie w zaburzeniach neuropsychiatrycznych, takich jak schizofrenia, choroba afektywna dwubiegunowa, duża depresja, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i zaburzenia ze spektrum autyzmu.
RNA oddziałujące z piwi (piRNA)
piRNA reprezentują największą klasę małych niekodujących cząsteczek RNA ulegających ekspresji w komórkach zwierzęcych, pochodzących z wielu różnych źródeł, w tym z powtarzalnego DNA i transpozonów. Jednak biogeneza piRNA jest również najmniej dobrze poznana. piRNA wydają się działać zarówno na poziomie potranskrypcyjnym, jak i chromatyny. Różnią się one od miRNA co najmniej wzrostem pod względem wielkości i złożoności. Małe interferujące RNA związane z powtórzeniami ( rasiRNA ) są uważane za podgatunek piRNA.
Mechanizm
Najbardziej podstawowy przepływ mechanistyczny dla wyciszania RNA jest następujący: (Aby uzyskać bardziej szczegółowe wyjaśnienie mechanizmu, zapoznaj się z artykułem dotyczącym mechanizmu RNAi: Cellular .)
1: RNA z odwróconymi powtórzeniami konstrukty spinki do włosów/panhandle --> 2: dsRNA --> 3: miRNA / siRNA --> 4: RISC --> 5: Zniszczenie docelowego mRNA
- Odkryto, że najlepszym prekursorem dobrego wyciszania RNA jest posiadanie jednoniciowego antysensownego RNA z odwróconymi powtórzeniami, które z kolei budują małe RNA typu spinka do włosów i konstrukty typu „panhandle”. Konstrukty szpilki do włosów lub rękojeści istnieją tak, że RNA może pozostać niezależny i nie hybrydyzować z innymi niciami RNA.
- Te małe RNA o strukturze spinki do włosów i/lub panhands są następnie transportowane z jądra do cytozolu przez jądrowy receptor eksportowy zwany exportin-5, a następnie są przekształcane w dsRNA, dwuniciowy RNA, który, podobnie jak DNA, jest serią dwuniciową od nukleotydów . Gdyby mechanizm nie wykorzystywał dsRNA, a tylko pojedyncze nici, istniałaby większa szansa na hybrydyzację z innymi „dobrymi” mRNA. Jako podwójna nitka może być trzymana na żądanie, gdy jest potrzebna.
- Następnie dsRNA jest cięte przez Dicer na małe (21-28 nt = długość nukleotydów ) nici miRNA ( mikroRNA ) lub siRNA (krótkie interferujące RNA). Dicer to endorybonukleaza RNaza , która jest kompleksem białka zmieszanego z nici RNA.
- Wreszcie, dwuniciowe miRNA / siRNA rozdzielają się na pojedyncze nici; antysensowny RNA nici z dwóch będzie łączyć się z innym endoribonuclease enzym kompleks zwany RISC ( indukowany RNA tłumiących kompleks ), który zawiera katalityczny składnik Argonaute i będzie prowadzić RISC zerwać „doskonale komplementarny” docelowy mRNA lub wirusowego genomowego RNA aby mógł zostać zniszczony.
- Oznacza to, że na podstawie obszaru specyficznego dla krótkiej sekwencji zostanie wycięty odpowiedni mRNA. Dla pewności będzie cięty również w wielu innych miejscach. (Jeżeli urządzenie pracuje tylko z długim odcinku, to nie będzie większa szansa, że nie będzie mieć czas, aby dopasować się do odpowiadającego mu długi mRNA). To wykazano również, że powtarzające związane krótkie RNA interferencyjne ( rasiRNA ) mają rola w kierowaniu modyfikacją chromatyny.
Aby uzyskać animowane wyjaśnienie mechanizmu RNAi autorstwa Nature Reviews, zobacz sekcję Linki zewnętrzne poniżej.
Funkcje biologiczne
Odporność na wirusy lub transpozony
Wyciszanie RNA to mechanizm, który nasze komórki (i komórki ze wszystkich królestw ) wykorzystują do zwalczania wirusów RNA i transpozonów (pochodzących z naszych własnych komórek, a także z innych nośników). W przypadku wirusów RNA są one natychmiast niszczone przez wspomniany powyżej mechanizm . W przypadku transpozonów sprawa jest nieco bardziej pośrednia. Ponieważ transpozony znajdują się w różnych częściach genomu, różne transkrypcje z różnych promotorów wytwarzają komplementarne mRNA, które mogą ze sobą hybrydyzować. Kiedy tak się dzieje, maszyneria RNAi zaczyna działać, osłabiając mRNA białek, które byłyby wymagane do poruszania samych transpozonów.
Regulacja w dół genów
Aby uzyskać szczegółowe wyjaśnienie regulacji w dół genów, zobacz RNAi: regulacja w dół genów
Regulacja w górę genów
Szczegółowe wyjaśnienie regulacji w górę genów, patrz RNAi: regulacja w górę genów
Wyciszanie RNA również podlega regulacji
W ten sam sposób, w jaki wyciszanie RNA reguluje dalsze docelowe mRNA , samo wyciszanie RNA jest regulowane. Na przykład, sygnały wyciszania rozprzestrzeniają się między komórkami przez grupę enzymów zwanych RdRP ( polimerazy RNA zależne od RNA ) lub RDR.
Praktyczne zastosowania
Coraz większa wiedza na temat mechanizmów wyciszania genów małych RNA związanych z degradacją mRNA specyficzną dla sekwencji za pośrednictwem dsRNA ma bezpośredni wpływ na dziedziny genomiki funkcjonalnej, biomedycyny i biologii eksperymentalnej. Poniższa sekcja opisuje różne zastosowania związane z efektami wyciszania RNA. Obejmują one zastosowania w biotechnologii, terapii i badaniach laboratoryjnych. Techniki bioinformatyczne są również stosowane do identyfikowania i charakteryzowania dużej liczby małych RNA i ich celów.
Biotechnologia
Sztuczne wprowadzenie długich dsRNA lub siRNA zostało przyjęte jako narzędzie do inaktywacji ekspresji genów, zarówno w hodowanych komórkach, jak iw żywych organizmach. Rozdzielczość strukturalna i funkcjonalna małych RNA jako efektorów wyciszania RNA ma bezpośredni wpływ na biologię eksperymentalną. Na przykład, dsRNA można zsyntetyzować, aby mieć określoną sekwencję komplementarną do interesującego genu. Po wprowadzeniu do komórki lub układu biologicznego jest rozpoznawany jako egzogenny materiał genetyczny i aktywuje odpowiednią ścieżkę wyciszania RNA. Mechanizm ten można wykorzystać do obniżenia ekspresji genów w odniesieniu do celu, co jest przydatne do badania utraty funkcji genów w stosunku do fenotypu. Oznacza to, że badanie fenotypowych i/lub fizjologicznych skutków obniżenia ekspresji może ujawnić rolę produktu genu. Obserwowane efekty mogą być tak zniuansowane, że niektóre metody mogą odróżnić „knockdown” (zmniejszenie ekspresji) i „knockout” (eliminacja ekspresji) genu. Technologie interferencji RNA zostały ostatnio zauważone jako jedna z najczęściej stosowanych technik w genomice funkcjonalnej. Przesiewy opracowane przy użyciu małych RNA zostały wykorzystane do identyfikacji genów zaangażowanych w podstawowe procesy, takie jak podział komórek, apoptoza i regulacja tłuszczu.
Biomedycyna
Co najmniej od połowy 2000 r. rośnie zainteresowanie opracowywaniem krótkich interferujących RNA do zastosowań biomedycznych i terapeutycznych. To zainteresowanie wzmacnia rosnąca liczba eksperymentów, które z powodzeniem wykazały potencjał kliniczny i bezpieczeństwo małych RNA w zwalczaniu chorób, od infekcji wirusowych po nowotwory, a także zaburzenia neurodegeneracyjne. W 2004 r. w Stanach Zjednoczonych do Agencji ds. Żywności i Leków złożono pierwsze wnioski o badanie nowych leków dla siRNA ; był przeznaczony do terapii zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem . Wyciszanie RNA in vitro i in vivo zostało osiągnięte poprzez stworzenie wyzwalaczy (kwasów nukleinowych, które indukują RNAi) poprzez ekspresję w wirusach lub syntezę oligonukleotydów. Optymistycznie wiele badań wskazuje, że terapie oparte na małych RNA mogą oferować nową i potężną broń przeciwko patogenom i chorobom, w przypadku których terapia drobnocząsteczkowa/farmakologiczna i szczepionkowa/biologiczna zawiodła lub okazała się mniej skuteczna w przeszłości. Ostrzega się jednak również, że projektowanie i dostarczanie małych cząsteczek efektorowych RNA powinno być starannie rozważone w celu zapewnienia bezpieczeństwa i skuteczności.
Rola wyciszania RNA w lecznictwie, medycynie klinicznej i diagnostyce jest szybko rozwijającą się dziedziną i oczekuje się, że w ciągu najbliższych kilku lat niektóre związki wykorzystujące tę technologię osiągną akceptację rynkową. Raport został podsumowany poniżej, aby podkreślić wiele dziedzin klinicznych, w których wyciszanie RNA odgrywa coraz ważniejszą rolę, z których najważniejsze to choroby oczu i siatkówki, nowotwory, choroby nerek, obniżanie poziomu LDL i działanie przeciwwirusowe. Poniższa tabela przedstawia listę terapii opartych na RNAi znajdujących się obecnie w różnych fazach badań klinicznych. Stan tych badań można monitorować na stronie internetowej ClinicalTrials.gov , usługi National Institutes of Health ( NIH ). Na uwagę zasługują opracowywane metody leczenia zaburzeń oczu i siatkówki, które były jednymi z pierwszych związków, które osiągnęły rozwój kliniczny. AGN211745 (sirna027) (Allergan) i bevasiranib (Cand5) (Opko) przeszły badania kliniczne do leczenia zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, ale próby zakończono, zanim związki trafiły na rynek. Inne związki opracowywane dla chorób oczu obejmują SYL040012 (Sylentis) i QPI-007 (Quark). SYL040012 (bamosinan) jest kandydatem na lek w trakcie opracowywania klinicznego na jaskrę, postępującą neurdegenerację nerwu wzrokowego często związaną ze zwiększonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym; QPI-007 jest kandydatem do leczenia jaskry zamykającego się kąta i nietętniczej przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego; oba związki są obecnie w fazie II badań klinicznych. Kilka związków jest również w trakcie opracowywania na schorzenia takie jak rak i rzadkie choroby.
| Domena kliniczna | Narkotyk | Wskazanie | Cel |
|---|---|---|---|
| Zaburzenia oka i siatkówki | TD101 | Wrodzona pachyonychia | Keratyna 6A N171K mutant |
| Zaburzenia oka i siatkówki | QPI-1007 | Nietętnicza przednia niedokrwienna neuropatia nerwu wzrokowego | Kaspaza 2 |
| Zaburzenia oka i siatkówki | AGN211745 | Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem, neowaskularyzacja naczyniówki | VEGFR1 |
| Zaburzenia oka i siatkówki | PF-655 | Cukrzycowy obrzęk plamki, zwyrodnienie plamki związane z wiekiem | RTP801 |
| Zaburzenia oka i siatkówki | SYL040012 | Jaskra | β2 receptor adrenergiczny |
| Zaburzenia oka i siatkówki | Bewasiranib | Cukrzycowy obrzęk plamki | VEGF |
| Zaburzenia oka i siatkówki | Bewasiranib | Zwyrodnienie plamki żółtej | VEGF |
| Nowotwór | CEQ508 | Rodzinna polipowatość gruczolakowata | β-katenina |
| Nowotwór | ALN-PLK1 | Guz wątroby | PLK1 |
| Nowotwór | KIEŁ | Guz lity | Furin |
| Nowotwór | CALAA-01 | Guz lity | RRM2 |
| Nowotwór | SPC2996 | przewlekła białaczka limfocytowa | BCL-2 |
| Nowotwór | ALN-VSP02 | Guz lity | VEGF, białko wrzeciona kinezyny |
| Nowotwór | NCT00672542 | Czerniak z przerzutami | LMP2, LMP7 i MECL1 |
| Nowotwór | Atu027 | Stałe nowotwory złośliwe | PKN3 |
| Zaburzenia nerek | QPI-1002/I5NP | Ostre uszkodzenie nerek | p53 |
| Zaburzenia nerek | QPI-1002/I5NP | Dysfunkcja przeszczepu nerki | p53 |
| Zaburzenia nerek | QPI-1002/I5NP | Uszkodzenie nerek ostra niewydolność nerek | p53 |
| Obniżenie LDL | TKM-ApoB | Hipercholesterolemia | APOB |
| Obniżenie LDL | PRO-040,201 | Hipercholesterolemia | APOB |
| Środek przeciwwirusowy | miravirsen | Wirus zapalenia wątroby typu C | miR-122 |
| Środek przeciwwirusowy | pHIV7-shi-TAR-CCR5RZ | HIV | Białko Tat HIV, RNA HIV TAR, ludzkie CCR5 |
| Środek przeciwwirusowy | ALN-RSV01 | RSV | Nukleokapsyd RSV |
| Środek przeciwwirusowy | ALN-RSV01 | RSV u pacjentów po przeszczepieniu płuc | Nukleokapsyd RSV |
Główne wyzwanie
Podobnie jak w przypadku konwencjonalnych leków, głównym wyzwaniem w opracowywaniu skutecznych odgałęzień leków opartych na RNAi jest precyzyjne dostarczanie wyzwalaczy RNAi tam, gdzie są one potrzebne w organizmie. Powodem, dla którego antidotum na zwyrodnienie plamki oka odniosło sukces wcześniej niż antidotum na inne choroby, jest to, że gałka oczna jest prawie zamkniętym układem, a serum można wstrzykiwać igłą dokładnie tam, gdzie to konieczne. W przyszłości skuteczne leki będą mogły wylądować tam, gdzie jest to potrzebne, prawdopodobnie z pomocą nanobotów. Poniżej znajduje się tabela przedstawiająca istniejące sposoby dostarczania wyzwalaczy RNAi.
| Gatunek/preparat | Pojemność opakowania | Zastosowania i rozważania |
|---|---|---|
| Wektor wirusowy | ||
| Adenowirus | Zwykle < 10 Kb | Wektor dsDNA o dużej pojemności pakowania, ekspresja przejściowa, wysoce immunogenny |
| Wirus związany z adenowirusem (AAV) | ~4,5Kb | wektor ssDNA, mała pojemność pakowania, umiarkowanie immunogenna, trwała ekspresja w niedzielących się komórkach, pseudotypowanie/inżynieria kapsydu ułatwia specyficzne ukierunkowanie na komórki |
| lentiwirus | Do 13,5 KB | wektor RNA, dostępne formy integrujące i niekompetentne, mniej immunogenne niż adenowirus lub AAV, pseudotypowanie otoczki ułatwia celowanie w komórki, produkcja kliniczna jest trudniejsza niż w przypadku adenowirusa lub AAV |
| Wirus opryszczki pospolitej | 150 KB | wektor DNA, episomalny, trwała ekspresja, immunogenny |
| Bakteryjne gatunki wektorów (minikomórki bakteryjne mogą przenosić plazmidy, siRNA lub leki) | ||
| Escherichis coli , S. Typhymurium | Dostarczanie krótkiego RNA lub siRNA o strukturze spinki do włosów do tkanki jelitowej | |
| Preparaty niewirusowe | ||
| Nanocząsteczka | Samoorganizacja, może być skierowana do określonych receptorów, wymaga specjalistycznej wiedzy technicznej do przygotowania | |
| Stabilna cząstka lipidowa kwasu nukleinowego (SNALP) | Stabilny w dostarczaniu ogólnoustrojowym, dostarczanie szerokiej gamy komórek | |
| Aptamer | Celowanie w określone receptory wymaga zaawansowanych badań przesiewowych, aby się rozwinąć | |
| Cholesterol | Stabilny do dostarczania ogólnoustrojowego, dostarczanie szerokiego typu komórkowego |
Laboratorium
Społeczność naukowa szybko wykorzystała wyciszanie RNA jako narzędzie badawcze. Strategiczne celowanie w mRNA może dostarczyć dużej ilości informacji o funkcji genu i jego możliwości włączania i wyłączania. Indukowane wyciszanie RNA może służyć jako kontrolowana metoda tłumienia ekspresji genów. Ponieważ maszyneria jest zachowana u większości eukariontów, eksperymenty te dobrze skalują się do szeregu organizmów modelowych. W praktyce ekspresja syntetycznych krótkich RNA o strukturze spinki do włosów może być wykorzystana do osiągnięcia stabilnego efektu knock-down. Jeśli można wytworzyć promotory do ekspresji tych zaprojektowanych krótkich RNA o strukturze spinki do włosów, wynikiem jest często silne, stabilne i kontrolowane wyciszenie genów zarówno w kontekście in vitro, jak i in vivo. Systemy wektorowe RNA krótkiej spinki do włosów mogą być postrzegane jako z grubsza analogiczne w zakresie do stosowania systemów nadekspresji cDNA. Ogólnie rzecz biorąc, syntetyczne i naturalne małe RNA okazały się ważnym narzędziem do badania funkcji genów w komórkach i zwierzętach.
Podejścia bioinformatyczne do identyfikacji małych RNA i ich celów przyniosły kilkaset, jeśli nie tysiące kandydatów na małe RNA, co do których przewiduje się, że wpłyną na ekspresję genów u roślin, C. elegans, D. melanogaster, danio pręgowanego, myszy, szczura i człowieka. Metody te są w dużej mierze ukierunkowane na identyfikację małych kandydatów RNA do eksperymentów z nokautem, ale mogą mieć szersze zastosowania. Jedno podejście bioinformatyczne oceniało kryteria konserwacji sekwencji poprzez filtrowanie komplementarnych miejsc wiązania celu w nasionach. Cytowane badanie przewidywało, że około jedna trzecia genów ssaków będzie regulowana, w tym przypadku, przez miRNA.
Analiza etyki i korzyści i ryzyka
Jednym z aspektów wyciszania RNA, który należy wziąć pod uwagę, jest jego możliwy wpływ poza cel, toksyczność i metody dostarczania. Jeśli wyciszanie RNA ma stać się lekiem konwencjonalnym, musi najpierw przejść przez typowe problemy etyczne biomedycyny. Korzystając z analizy ryzyka i korzyści, naukowcy mogą określić, czy wyciszanie RNA jest zgodne z ideologiami etycznymi, takimi jak nieszkodzenie, dobroczynność i autonomia.
Istnieje ryzyko stworzenia wirusów zdolnych do infekcji, które mogą zainfekować osoby, które nie wyrażą na to zgody. Istnieje również ryzyko wpłynięcia na przyszłe pokolenia w oparciu o te zabiegi. Te dwa scenariusze, w odniesieniu do autonomii, mogą być nieetyczne. W tej chwili niebezpieczne metody dostarczania i niezamierzone aspekty wirusów wektorowych stanowią argument przeciwko wyciszeniu RNA.
Pod względem efektów poza celem, siRNA może indukować wrodzone odpowiedzi interferonu, hamować endogenne miRNA poprzez nasycenie i może mieć sekwencje komplementarne do innych mRNA niedocelowych. Te odbiegające od celu cele mogą również mieć regulację w górę, taką jak onkogeny i geny antyapoptotyczne. Toksyczność wyciszania RNA jest nadal analizowana, ponieważ istnieją sprzeczne doniesienia.
Wyciszanie RNA szybko się rozwija, dlatego kwestie etyczne wymagają dalszej dyskusji. Znając ogólne zasady etyczne, musimy stale przeprowadzać analizę ryzyka i korzyści.
Zobacz też
Bibliografia
Zewnętrzne linki
- Animację Nature Reviews wyjaśniającą mechanizm działania RNAi można znaleźć tutaj.