Syntetyczna tablica genetyczna - Synthetic genetic array

Syntetyczna analiza macierzy genetycznych ( SGA ) to wysokowydajna technika do badania syntetycznych, śmiertelnych i syntetycznych interakcji genetycznych chorych ( SSL ). SGA pozwala na systematyczne konstruowanie podwójnych mutantów przy użyciu kombinacji rekombinowanych technik genetycznych , etapów kojarzenia i selekcji. Stosując metodologię SGA, mutant delecji zapytanego genu można krzyżować z zestawem delecji całego genomu w celu zidentyfikowania dowolnych interakcji SSL , uzyskując informacje funkcjonalne o genezie zapytania i genach, z którymi oddziałuje. Zastosowanie SGA na dużą skalę, w którym ~130 genów zapytania krzyżowano z zestawem ~5000 żywotnych mutantów delecyjnych w drożdżach, ujawniło sieć genetyczną zawierającą ~1000 genów i ~4000 interakcji SSL. Wyniki tego badania wykazały, że geny o podobnej funkcji mają tendencję do interakcji ze sobą, a geny o podobnych wzorcach interakcji genetycznych często kodują produkty, które mają tendencję do działania w tej samej ścieżce lub kompleksie. Analiza syntetycznej macierzy genetycznej została początkowo opracowana przy użyciu organizmu modelowego S. cerevisiae . Od tego czasu metoda ta została rozszerzona, aby objąć 30% genomu S. cerevisiae . Od tego czasu opracowano metodologię umożliwiającą analizę SGA u S. pombe i E. coli .

Ustawione drożdże wykazujące syntetyczne, śmiertelne interakcje. Syntetyczne oddziaływania śmiertelne to te pary kolonii, w których wzrost jest ograniczony lub nie ma go wcale.

Tło

Analiza syntetycznej macierzy genetycznej została początkowo opracowana przez Tong et al. w 2001 roku i od tego czasu jest używany przez wiele grup pracujących w szerokim zakresie dziedzin biomedycznych. SGA wykorzystuje cały genomowy zestaw do wycinania drożdży stworzony w ramach projektu delecji genomu drożdży.

Procedura

Syntetyczną analizę macierz genetyczną na ogół przeprowadza się przy użyciu macierzy kolonii na płytkach petriplate przy standardowych gęstościach (96, 384, 768, 1536). Aby przeprowadzić analizę SGA w S. cerevisae , delecję genu będącego przedmiotem zapytania krzyżuje się systematycznie z macierzą mutantów delecyjnych (DMA) zawierającą każdą żywą ORF z nokautem genomu drożdży (obecnie 4786 szczepów). Powstałe diploidy są następnie sporulowane przez przeniesienie do pożywki zawierającej zredukowany azot. Haploidalne komórki potomne są następnie poddane serii platings selekcji i inkubacji, aby wybrać dla podwójnych mutantów. Podwójne mutanty są przeszukiwane pod kątem interakcji SSL wizualnie lub przy użyciu oprogramowania do obrazowania, oceniając wielkość powstałych kolonii.

Replikacja kolonii drożdży podczas analizy SGA za pomocą robota napinającego

Robotyka

Ze względu na dużą liczbę precyzyjnych etapów replikacji w analizie SGA, roboty są szeroko stosowane do wykonywania manipulacji koloniami. Istnieje kilka systemów zaprojektowanych specjalnie do analizy SGA, które znacznie skracają czas analizy genu zapytania. Ogólnie rzecz biorąc, mają one szereg kołków, które są używane do przenoszenia komórek do iz płytek, z jednym systemem wykorzystującym jednorazowe podkładki kołków w celu wyeliminowania cykli mycia. Do analizy wielkości kolonii na podstawie obrazów płytek można wykorzystać programy komputerowe, automatyzując w ten sposób ocenę SGA i profilowanie chemiczno-genetyczne.

Krok w kierunku systemu badań genetycznych całego genomu drożdży o wysokiej zawartości (mapa drogowa SGA)

Istnieje sześć głównych elementów

  1. Kolekcja mutantów
  2. Materiały i narzędzia do obsługi mutantów
  3. System analizy obrazu
  4. Automatyczny system kwantyfikacji i punktacji
  5. Podejścia do potwierdzenia
  6. Narzędzia do analizy danych
  • Kolekcja mutantów

Pierwszym krokiem jest zebranie mutantów i utworzenie biblioteki mutantów na podłożu stałym lub płynnym. Nośniki stałe mogłyby być lepsze, ponieważ mogłyby zaoszczędzić mnóstwo czasu. Na wczesnym etapie tworzenia mutantów dokonano metodą rekombinacji homologicznej. Posiadamy doskonałą bibliotekę mutantów Saccharomyces cerevisiae , dobrze zbadanego organizmu modelowego.

Jednakże, jeśli próbujesz nowego, drożdżowego modelu, możesz być zmuszony do sekwencjonowania genomu i przewidzieć możliwą ORF na podstawie dobrego genomu drożdży referencyjnych (na przykład: z Saccharomyces cerevisiae). Rozważ szczególny przypadek: jeśli nie masz genomu referencyjnego, powinieneś przejść do analizy transkryptomu i genomu tego nowego organizmu modelowego.

  • Materiały i narzędzia do obsługi mutantów
    Po umieszczeniu biblioteki mutantów na stałym nośniku. Jeśli mutanty znajdują się na podłożu stałym, ułożyliśmy je w proporcji 1:3, tj. od jednego typu dzikiego do 3 mutantów typu dzikiego (dlaczego? Typ dziki działa jako kontrola wewnętrzna, a na podłożu stałym nie należy dzielić pożywienia równo, aby uniknąć stronniczość). Po uzyskaniu mutantów z usuniętym pojedynczym genem możesz uruchomić narzędzia do obsługi mutantów. W SGA jest to określane jako „Przypinanie”. Wersje ROTOR-HAD (zwane robotem napinającym) używane do napinania mutantów drożdży. Ta maszyna jest zainstalowana z przyjaznym dla użytkownika interfejsem, który pomaga przypinać próbki z płyt źródłowych do płyt eksperymentalnych
  1. System analizy obrazu
  2. Automatyczny system kwantyfikacji i punktacji
  3. Podejścia do potwierdzenia
  4. Narzędzia do analizy danych

Kolekcja mutantów

Zobacz też

Bibliografia