Diagnostyka molekularna - Molecular diagnostics
Diagnostyka molekularna to zbiór technik wykorzystywanych do analizy markerów biologicznych w genomie i proteomie oraz sposobu ekspresji genów w ich komórkach jako białek , wykorzystujących biologię molekularną do badań medycznych . W medycynie technika ta jest wykorzystywana do diagnozowania i monitorowania choroby, wykrywania ryzyka i decydowania, które terapie będą najlepsze dla poszczególnych pacjentów, a w rolnictwie bioasekuracja podobnie do monitorowania chorób upraw i zwierząt gospodarskich , szacowania ryzyka i podejmowania decyzji, jakie środki kwarantanny należy podjąć .
Analizując specyfikę pacjenta i jego choroby, diagnostyka molekularna daje perspektywę medycyny spersonalizowanej . Testy te są przydatne w wielu specjalnościach medycznych , w tym w chorobach zakaźnych , onkologii , typowaniu antygenów ludzkich leukocytów (które badają i prognozują funkcję odpornościową ), koagulacji i farmakogenomice — przewidywanie genetyczne, które leki będą działać najlepiej. Nakładają się one na chemię kliniczną (testy medyczne na płynach ustrojowych).
Historia
Dziedzina biologii molekularnej rozwinęła się pod koniec XX wieku, podobnie jak jej zastosowanie kliniczne. W 1980 roku Yuet Wai Kan i in . zasugerował prenatalny test genetyczny na talasemię, który nie opierał się na sekwencjonowaniu DNA – wtedy w okresie niemowlęcym – ale na enzymach restrykcyjnych, które tną DNA tam, gdzie rozpoznają określone krótkie sekwencje, tworząc różne długości nici DNA w zależności od allelu (zmienności genetycznej) płód opętany. W latach 80. wyrażenie to było używane w nazwach firm, takich jak Molecular Diagnostics Incorporated i Bethseda Research Laboraties Molecular Diagnostics .
W latach 90. identyfikacja nowo odkrytych genów i nowych technik sekwencjonowania DNA doprowadziła do powstania odrębnej dziedziny molekularnej i genomicznej medycyny laboratoryjnej; w 1995 roku utworzono Stowarzyszenie Patologii Molekularnej (AMP), aby nadać jej strukturę. W 1999 roku AMP był współzałożycielem The Journal of Medical Diagnostics . Firma Informa Healthcare uruchomiła Expert Reviews in Medical Diagnostics w 2001 roku. Od 2002 roku projekt HapMap agregował informacje na temat jednoliterowych różnic genetycznych, które powtarzają się w populacji ludzkiej — polimorfizmów pojedynczego nukleotydu — i ich związku z chorobą. W 2012 roku techniki diagnostyki molekularnej talasemii wykorzystują testy hybrydyzacji genetycznej w celu zidentyfikowania określonego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu powodującego chorobę.
Ponieważ komercyjne zastosowanie diagnostyki molekularnej zyskało na znaczeniu, w centrum uwagi znajduje się debata na temat patentowania odkryć genetycznych . W 1998 roku Unia Europejska jest Dyrektywa 98/44 / ECclarified że patenty na sekwencje DNA były dopuszczalne. W 2010 roku w USA AMP pozwała Myriad Genetics, aby zakwestionować patenty tej ostatniej dotyczące dwóch genów, BRCA1 i BRCA2 , które są związane z rakiem piersi. W 2013 roku Sąd Najwyższy Stanów Zjednoczonych częściowo zgodził się , orzekając, że naturalnie występująca sekwencja genu nie może zostać opatentowana.
Techniki
Rozwój z narzędzi badawczych
Uprzemysłowienie narzędzi analitycznych biologii molekularnej umożliwiło praktyczne ich stosowanie w klinikach. Miniaturyzacja w jedno urządzenie ręczne może wprowadzić diagnostykę medyczną do kliniki, biura lub domu. Laboratorium klinicznym wymaga wysokich standardów niezawodności; diagnostyka może wymagać akredytacji lub podlegać przepisom dotyczącym wyrobów medycznych. Od 2011 r. niektóre laboratoria kliniczne w USA stosowały jednak testy sprzedawane „wyłącznie do celów badawczych”.
Procesy laboratoryjne muszą być zgodne z obowiązującymi w Stanach Zjednoczonych przepisami, takimi jak Clinical Laboratory Improvement Poprawki , Health Insurance Portability and Accountability Act , Good Laboratory Practice oraz Food and Drug Administration . Laboratoryjne systemy zarządzania informacją pomagają w śledzeniu tych procesów. Rozporządzenie dotyczy zarówno personelu, jak i zaopatrzenia. Od 2012 r. dwanaście stanów USA wymaga licencji patologów molekularnych; kilka rad, takich jak American Board of Medical Genetics i American Board of Pathology, certyfikuje technologów, przełożonych i dyrektorów laboratoriów.
Automatyzacja i kody kreskowe próbek maksymalizują przepustowość i zmniejszają możliwość wystąpienia błędu lub zanieczyszczenia podczas ręcznej obsługi i raportowania wyników. Dostępne są teraz pojedyncze urządzenia do wykonania testu od początku do końca.
Testy
Diagnostyka molekularna wykorzystuje testy biologiczne in vitro, takie jak PCR- ELISA lub hybrydyzacja fluorescencyjna in situ . Test wykrywa cząsteczkę, często w niskich stężeniach, która jest markerem choroby lub ryzyka w próbce pobranej od pacjenta. Przechowywanie próbki przed analizą ma kluczowe znaczenie. Należy zminimalizować ręczną obsługę. Delikatna cząsteczka RNA stwarza pewne wyzwania. Jako część komórkowego procesu ekspresji genów jako białek, oferuje miarę ekspresji genów, ale jest podatna na hydrolizę i rozpad przez wszechobecne enzymy RNAzy . Próbki można szybko zamrozić w ciekłym azocie lub inkubować w środkach konserwujących.
Ponieważ metody diagnostyki molekularnej mogą wykrywać czułe markery, testy te są mniej inwazyjne niż tradycyjna biopsja . Na przykład, ponieważ bezkomórkowe kwasy nukleinowe występują w ludzkim osoczu , zwykła próbka krwi może wystarczyć do pobrania informacji genetycznej z guzów, przeszczepów lub nienarodzonego płodu. Wiele, ale nie wszystkie metody diagnostyki molekularnej oparte na wykrywaniu kwasów nukleinowych wykorzystują reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu znacznego zwiększenia liczby cząsteczek kwasu nukleinowego, a tym samym amplifikacji sekwencji docelowej w próbce pacjenta. PCR to metoda amplifikacji matrycy DNA przy użyciu syntetycznych starterów, polimerazy DNA i dNTP. Mieszanina jest poddawana cyklom między co najmniej 2 temperaturami: wysoką temperaturą do denaturacji dwuniciowego DNA w jednoniciowe cząsteczki i niską temperaturą hybrydyzacji startera z matrycą i polimerazy do wydłużenia startera. Każdy cykl temperaturowy teoretycznie podwaja ilość sekwencji docelowej. Wykrywanie zmienności sekwencji za pomocą PCR zazwyczaj obejmuje zaprojektowanie i zastosowanie odczynników oligonukleotydowych, które amplifikują interesujący wariant skuteczniej niż sekwencja typu dzikiego. PCR jest obecnie najszerzej stosowaną metodą wykrywania sekwencji DNA. Wykrywanie markera może wykorzystywać PCR w czasie rzeczywistym, bezpośrednie sekwencjonowanie, chipy mikromacierzowe – prefabrykowane chipy, które testują wiele markerów na raz lub MALDI-TOF. Ta sama zasada dotyczy proteomu i genomu . Wysokowydajne macierze białkowe mogą wykorzystywać komplementarne DNA lub przeciwciała do wiązania, a zatem mogą równolegle wykrywać wiele różnych białek. Testy diagnostyki molekularnej różnią się znacznie czułością, czasem zwrotu, kosztami, zasięgiem i zatwierdzeniem przez organy regulacyjne. Różnią się również poziomem walidacji stosowanej w korzystających z nich laboratoriach. W związku z tym wymagana jest solidna lokalna walidacja zgodnie z wymogami regulacyjnymi i stosowanie odpowiednich kontroli, zwłaszcza gdy wynik może być wykorzystany do podjęcia decyzji dotyczącej leczenia pacjenta.
Korzyści
Prenatalny
Konwencjonalne testy prenatalne pod kątem nieprawidłowości chromosomalnych, takich jak zespół Downa, polegają na analizie liczby i wyglądu chromosomów – kariotypu . Testy diagnostyki molekularnej, takie jak porównawcza hybrydyzacja genomowa na mikromacierzach, testują próbkę DNA, a ze względu na wolne od komórek DNA w osoczu mogą być mniej inwazyjne, ale od 2013 r. nadal stanowią uzupełnienie konwencjonalnych testów.
Leczenie
Niektóre polimorfizmy pojedynczego nukleotydu pacjenta — niewielkie różnice w jego DNA — mogą pomóc przewidzieć, jak szybko będą metabolizować określone leki; to się nazywa farmakogenomika . Na przykład enzym CYP2C19 metabolizuje kilka leków, takich jak środek przeciwzakrzepowy Clopidogrel , do postaci aktywnych. Niektórzy pacjenci mają polimorfizmy w określonych miejscach genu 2C19, które powodują słabe metabolizmy tych leków; lekarze mogą przetestować te polimorfizmy i dowiedzieć się, czy leki będą w pełni skuteczne dla tego pacjenta. Postępy w biologii molekularnej pomogły wykazać, że niektóre zespoły, które wcześniej były klasyfikowane jako pojedyncza choroba, to w rzeczywistości wiele podtypów o całkowicie różnych przyczynach i metodach leczenia. Diagnostyka molekularna może pomóc zdiagnozować podtyp — na przykład infekcje i nowotwory — lub analizę genetyczną choroby z elementem dziedzicznym, takim jak zespół Silvera-Russella .
Choroba zakaźna
Diagnostyka molekularna służy do identyfikacji chorób zakaźnych, takich jak chlamydia , wirus grypy i gruźlica ; lub specyficzne szczepy, takie jak wirus H1N1 lub SARS-CoV-2 . Identyfikacja genetyczna może być szybka; na przykład test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli diagnozuje pasożyta malarii i jest wystarczająco wytrzymały dla krajów rozwijających się. Ale pomimo tych postępów w analizie genomu, w 2013 roku infekcje są nadal częściej identyfikowane za pomocą innych metod – ich proteomu, bakteriofaga lub profilu chromatograficznego . Diagnostyka molekularna służy również do zrozumienia konkretnego szczepu patogenu – na przykład poprzez wykrycie posiadanych przez niego genów oporności na leki – a zatem jakich terapii należy unikać. Ponadto można wdrożyć testy oparte na sekwencjonowaniu metagenomicznym nowej generacji w celu identyfikacji organizmów chorobotwórczych bez uprzedzeń.
Zarządzanie ryzykiem choroby
Genom pacjenta może zawierać dziedziczną lub losową mutację, która wpływa na prawdopodobieństwo rozwoju choroby w przyszłości. Na przykład zespół Lyncha jest chorobą genetyczną, która predysponuje pacjentów do raka jelita grubego i innych nowotworów; wczesne wykrycie może prowadzić do ścisłego monitorowania, co zwiększa szanse pacjenta na dobry wynik. Ryzyko sercowo-naczyniowe jest wskazywane przez markery biologiczne, a badania przesiewowe mogą mierzyć ryzyko, że dziecko urodzi się z chorobą genetyczną, taką jak mukowiscydoza . Testy genetyczne są etycznie złożone: pacjenci mogą nie chcieć stresu związanego ze znajomością ryzyka. W krajach, w których nie ma powszechnej opieki zdrowotnej, znane ryzyko może zwiększyć składki ubezpieczeniowe.
Nowotwór
Rak to zmiana w procesach komórkowych, które powodują, że guz wymyka się spod kontroli. Komórki rakowe czasami mają mutacje w onkogenach , takich jak KRAS i CTNNB1 (β-katenina). Analiza sygnatury molekularnej komórek nowotworowych — DNA i jego poziomów ekspresji za pośrednictwem informacyjnego RNA — umożliwia lekarzom scharakteryzowanie nowotworu i wybór najlepszej terapii dla swoich pacjentów. Od 2010 r. testy, które zawierają szereg przeciwciał przeciwko określonym cząsteczkom markerów białkowych, są nową technologią; są nadzieje na te testy multipleksowe, które mogą mierzyć wiele markerów jednocześnie. Inne potencjalne przyszłe biomarkery obejmują cząsteczki mikroRNA , których komórki rakowe wyrażają więcej niż zdrowe.
Rak to choroba o nadmiernych przyczynach molekularnych i ciągłej ewolucji. Istnieje również heterogeniczność choroby nawet u osobnika. Badania molekularne nad rakiem dowiodły znaczenia mutacji kierowcy we wzroście i przerzutach guzów. W badaniach nad rakiem opracowano wiele technologii wykrywania wariacji sekwencji. Technologie te można ogólnie podzielić na trzy podejścia: reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), hybrydyzacja i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Obecnie wiele testów PCR i hybrydyzacyjnych zostało zatwierdzonych przez FDA jako diagnostyka in vitro. Testy NGS są jednak nadal na wczesnym etapie diagnostyki klinicznej.
Jednym z istotnych problemów w przeprowadzeniu molekularnego testu diagnostycznego na raka jest wykrywanie zmienności sekwencji DNA. Próbki z biopsji guza stosowane do diagnostyki zawsze zawierają tylko 5% wariantu docelowego w porównaniu z sekwencją typu dzikiego. Ponadto, w przypadku nieinwazyjnych zastosowań z krwi obwodowej lub moczu, test DNA musi być wystarczająco specyficzny, aby wykryć mutacje o różnej częstotliwości alleli poniżej 0,1%.
Obecnie, poprzez optymalizację tradycyjnego PCR, pojawił się nowy wynalazek, system mutacji amplifikacyjnych opornych na działanie mutacji (ARMS) jest metodą wykrywania wariantów sekwencji DNA w raku. Zasadą ARMS jest to, że enzymatyczna aktywność wydłużania polimeraz DNA jest bardzo wrażliwa na niedopasowania w pobliżu końca 3' startera. Wiele różnych firm opracowało testy diagnostyczne oparte na starterach ARMS PCR. Na przykład Qiagen therascreen, Roche cobas i Biomerieux THxID opracowały zatwierdzone przez FDA testy PCR do wykrywania raka płuc, okrężnicy i przerzutowych mutacji czerniaka w genach KRAS, EGFR i BRAF. Ich zestawy IVD zostały zasadniczo zweryfikowane na genomowym DNA wyekstrahowanym z tkanki FFPE.
Istnieją również mikromacierze, które wykorzystują mechanizm hybrydyzacji do diagnostyki raka. Ponad milion różnych sond można zsyntetyzować na macierzy za pomocą technologii Genechip firmy Affymetrix z limitem wykrywania od jednej do dziesięciu kopii mRNA na studzienkę. Zoptymalizowane mikromacierze są zazwyczaj uważane za zapewniające powtarzalną względną ocenę ilościową różnych celów. Obecnie FDA zatwierdziła już szereg testów diagnostycznych wykorzystujących mikromacierze: testy MammaPrint firmy Agendia mogą informować o ryzyku nawrotu raka piersi poprzez profilowanie ekspresji 70 genów związanych z rakiem piersi; Autogenomika Test INFNITI CYP2C19 może profilować polimorfizmy genetyczne, których wpływ na odpowiedź terapeutyczną na leki przeciwdepresyjne jest duży; a CytoScan Dx firmy Affymetrix może ocenić niepełnosprawność intelektualną i wady wrodzone poprzez analizę mutacji chromosomowych.
W przyszłości narzędzia diagnostyczne dla raka będą prawdopodobnie koncentrować się na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Dzięki wykorzystaniu sekwencjonowania DNA i RNA do diagnostyki raka, technologia w dziedzinie narzędzi diagnostyki molekularnej będzie się lepiej rozwijać. Chociaż przepustowość i cena NGS zostały dramatycznie zmniejszone w ciągu ostatnich 10 lat około 100-krotnie, pozostaje nam co najmniej 6 rzędów wielkości od wykonywania głębokiego sekwencjonowania na poziomie całego genomu. Obecnie Ion Torrent opracował kilka paneli NGS opartych na translacyjnym AmpliSeq, na przykład Oncomine Comprehensive Assay. Koncentrują się na wykorzystaniu głębokiego sekwencjonowania genów związanych z rakiem do wykrywania rzadkich wariantów sekwencji.
Narzędzie diagnostyki molekularnej może być wykorzystane do oceny ryzyka raka. Na przykład test BRCA1/2 Myriad Genetics ocenia kobiety pod kątem ryzyka zachorowania na raka piersi przez całe życie. Ponadto niektóre nowotwory nie zawsze są stosowane z wyraźnymi objawami. Przydatne jest analizowanie ludzi, którzy nie wykazują wyraźnych objawów, a tym samym mogą wykryć raka we wczesnych stadiach. Na przykład test ColoGuard może być używany do badania przesiewowego osób powyżej 55 roku życia w kierunku raka jelita grubego . Rak jest chorobą długookresową z różnymi etapami progresji, narzędzia diagnostyki molekularnej mogą być wykorzystywane do prognozowania progresji nowotworu. Na przykład test OncoType Dx firmy Genomic Health może oszacować ryzyko raka piersi. Ich technologia może informować pacjentów o konieczności poszukiwania chemioterapii, gdy jest to konieczne, poprzez badanie poziomów ekspresji RNA w tkance z biopsji raka piersi.
Oczekuje się, że wraz z rosnącym poparciem rządowym w molekularnej diagnostyce DNA coraz większa liczba klinicznych testów do wykrywania DNA w przypadku nowotworów stanie się dostępna. Obecnie badania nad diagnostyką raka rozwijają się szybko, a ich celem są niższe koszty, mniejsze zużycie czasu i prostsze metody dla lekarzy i pacjentów.
Zobacz też
- Medycyna molekularna (szersze pole molekularnego rozumienia choroby)
- Patologia molekularna
- Test opracowany w laboratorium
- Patogeneza
- Patogenomika
- Patologia
- Medycyna precyzyjna
- Medycyna spersonalizowana