Aktywacja transkrypcyjna sterowana tetracykliną - Tetracycline-controlled transcriptional activation
Aktywacja transkrypcyjna kontrolowana tetracykliną to metoda indukowalnej ekspresji genów, w której transkrypcja jest odwracalnie włączana lub wyłączana w obecności antybiotyku tetracykliny lub jednej z jej pochodnych (np. doksycykliny ).
Ekspresja genów kontrolowana tetracykliną opiera się na mechanizmie oporności na leczenie antybiotykami tetracyklinowymi występującymi u bakterii Gram-ujemnych . W przyrodzie, P tet, promotor wyraża tetR, na represor i teta, białka pompy antybiotyk tetracyklinę z komórki.
Różnica między Tet-On i Tet-Off nie polega na tym, czy transaktywator włącza lub wyłącza gen, jak może sugerować nazwa; raczej oba białka aktywują ekspresję. Różnica dotyczy ich odpowiedniej odpowiedzi na tetracyklinę lub doksycyklinę (Dox, bardziej stabilny analog tetracykliny); Tet-Off aktywuje ekspresję w przypadku braku Dox, podczas gdy Tet-On aktywuje się w obecności Dox.
Tet-Off i Tet-On
Dwa najczęściej używane systemy ekspresji indukowalnej do badań biologii komórek eukariotycznych to Tet-Off i Tet-On. System Tet-Off do kontrolowania ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania w komórkach ssaków został opracowany przez profesorów Hermanna Bujarda i Manfreda Gossena na Uniwersytecie w Heidelbergu i po raz pierwszy opublikowany w 1992 roku.
System Tet-Off wykorzystuje białko transaktywatora tetracykliny (tTA) , które powstaje przez fuzję jednego białka TetR (represor tetracykliny) występującego w bakteriach Escherichia coli z domeną aktywacyjną innego białka VP16 , występującego w opryszczce. Wirus simpleksowy .
Powstałe białko tTA jest zdolne do wiązania się z DNA w określonych sekwencjach operatorskich TetO . W większości systemów Tet-Off kilka powtórzeń takich sekwencji TetO jest umieszczonych przed minimalnym promotorem, takim jak promotor CMV . Całość kilku sekwencji TetO z minimalnym promotorem nazywana jest elementem odpowiedzi na tetracyklinę (TRE), ponieważ odpowiada ona na wiązanie białka transaktywatora tetracykliny tTA poprzez zwiększoną ekspresję genu lub genów poniżej swojego promotora.
W systemie Tet-Off ekspresja genów kontrolowanych przez TRE może być hamowana przez tetracyklinę i jej pochodne. Wiążą tTA i uniemożliwiają wiązanie się z sekwencjami TRE, zapobiegając w ten sposób transaktywacji genów kontrolowanych przez TRE.
System Tet-On działa podobnie, ale w odwrotny sposób. Podczas gdy w systemie Tet-Off, tTA jest zdolne do wiązania operatora tylko wtedy, gdy nie jest związane z tetracykliną lub jedną z jej pochodnych, takich jak doksycyklina, w systemie Tet-On białko rtTA jest zdolne do wiązania operatora tylko wtedy, gdy jest związane. przez tetracyklinę. W ten sposób wprowadzenie doksycykliny do systemu inicjuje transkrypcję produktu genetycznego. System Tet-On jest czasami preferowany w stosunku do Tet-Off ze względu na jego szybszą reakcję.
Systemy ekspresyjne Tet-Off są również wykorzystywane do wytwarzania myszy transgenicznych, które warunkowo eksprymują gen będący przedmiotem zainteresowania.
Tet-On Advanced i Tet-On 3G
Transaktywator Tet-On Advanced (znany również jako rtTA2 S- M2 ) jest alternatywną wersją Tet-On, która wykazuje zmniejszoną ekspresję podstawową i działa przy 10-krotnie niższym stężeniu Dox niż Tet-Off. Ponadto uważa się, że jego ekspresja jest bardziej stabilna w komórkach eukariotycznych dzięki optymalizacji ludzkich kodonów i wykorzystaniu trzech minimalnych domen aktywacji transkrypcji. Został odkryty w 2000 roku jako jeden z dwóch ulepszonych mutantów przez H. Bujarda i jego współpracowników po losowej mutagenezie części represorowej Tet genu transaktywatora. Tet-On 3G (znany również jako rtTA-V10) jest podobna do Tet-On zaawansowane, lecz pochodzi z rtTA2 S -S2 niż rtTA2 S -m2. Jest również zoptymalizowany pod kątem ludzkich kodonów i składa się z trzech minimalnych domen aktywacyjnych VP16. Jednak białko Tet-On 3G ma pięć różnic aminokwasowych w porównaniu z Tet-On Advanced, co wydaje się jeszcze bardziej zwiększać jego wrażliwość na Dox. Tet-On 3G jest wrażliwy na 100-krotnie mniej Doxu i siedmiokrotnie bardziej aktywny niż oryginalny Tet-On.
Inne systemy
Inne systemy, takie jak system T-REx firmy Life Technologies, działają w inny sposób. Gen będący przedmiotem zainteresowania jest oflankowany przez znajdujący się powyżej promotor CMV i dwa miejsca TetO2. Ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest hamowana przez wysokie powinowactwo wiązania homodimerów TetR z każdą sekwencją TetO2 pod nieobecność tetracykliny. Wprowadzenie tetracykliny powoduje związanie jednej tetracykliny na każdym homodimerze TetR, a następnie uwolnienie TetO2 przez homodimery TetR. Rozłączenie homodimerów TetR i TetO2 powoduje derepresję genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Zmodyfikowana wersja T-REx to syntetyczny obwód biologiczny Linearizer , zoptymalizowany do strojenia ekspresji genów w komórkach eukariotycznych (pączkujących drożdży, ludzi itp.). Włączając miejsca TetO2 do promotora napędzającego ekspresję TetR, wytwarza ujemne sprzężenie zwrotne , które zapewnia jednorodną ekspresję (niski szum) i liniową odpowiedź na dawkę analogów tetracyklin.
Element odpowiedzi na tetracyklinę (TRE)
W najpowszechniej stosowanych plazmidach element odpowiedzi na tetracyklinę składa się z siedmiu powtórzeń sekwencji TetO bakteryjnej 19 pz (TCCCTATCAGTGATAGAGA) oddzielonych sekwencjami rozdzielającymi (na przykład: ACGATGTCGAGTTTAC). To właśnie TetO jest rozpoznawane i związane przez część TetR Tet-On lub Tet-Off. TRE jest zwykle umieszczany powyżej minimalnego promotora, który ma bardzo niską podstawową ekspresję przy braku związanego Tet-Off (lub Tet-On).
Zalety i wady
System Tet ma przewagę nad systemami warunkowej ekspresji genów Cre , FRT i ER (receptor estrogenu). W systemach Cre i FRT aktywacja lub nokaut genu jest nieodwracalna po osiągnięciu rekombinacji, podczas gdy w systemach Tet i ER jest odwracalna. System Tet ma bardzo ścisłą kontrolę nad ekspresją, podczas gdy system ER jest nieco nieszczelny. Jednak system Tet, który zależy od transkrypcji i późniejszej translacji genu docelowego, nie działa tak szybko jak system ER, który stabilizuje już eksprymowane białko docelowe po podaniu hormonu. Ponadto, ponieważ sekwencja tet-o 19 pz jest naturalnie nieobecna w komórkach ssaków, uważa się, że plejotropia jest zminimalizowana w porównaniu z hormonalnymi metodami kontroli. Podczas stosowania systemu Tet w hodowli komórkowej ważne jest, aby potwierdzić, że każda partia płodowej surowicy bydlęcej jest testowana w celu potwierdzenia, że zanieczyszczenia tetracyklin nie występują lub są zbyt niskie, aby zakłócać indukcję.
Mechanizm działania przeciwbakteryjnego działania tetracyklin polega na zakłócaniu translacji białek w bakteriach, a tym samym uszkadzaniu zdolności drobnoustrojów do wzrostu i naprawy; jednak translacja białek jest również zaburzona w mitochondriach eukariotycznych, co prowadzi do efektów, które mogą zafałszować wyniki eksperymentalne.