Transporter kasetowy wiążący ATP - ATP-binding cassette transporter

ABC Transporter, NBD
Witamina B 12 transporter, BtuCD PDB 1l7v
Identyfikatory
Symbol	ABC_trans
Pfam	PF00005
InterPro	IPR003439
PROSITE	PDOC00185
SCOP2	1b0u / zakres / SUPFAM
TCDB	3.A.1
Nadrodzina OPM	17
Białko OPM	3g5u
Dostępne struktury białkowe: Pfam   konstrukcje / ECOD   WPB WPB RCSB ; PDBe ; PDBj Suma PDB podsumowanie struktury

Flippaza lipidowa MsbA

Kompleks transportera molibdenianu AB ₂ C ₂ , stan otwarty

W ATP -binding transportery kasetowe ( transportery ABC ) to system transportu nadrodziny że jest jednym z największych i prawdopodobnie jeden z najstarszych rodzin genów . Jest reprezentowany we wszystkich istniejących typach , od prokariontów po ludzi .

Transportery ABC często składają się z wielu podjednostek, z których jedna lub dwie są białkami transbłonowymi, a jedna lub dwie z nich to ATPazy AAA związane z błoną . Podjednostki ATPazy wykorzystują energię wiązania i hydrolizy adenozynotrifosforanu (ATP) w celu dostarczenia energii potrzebnej do translokacji substratów przez błony, albo do wychwytu, albo do eksportu substratu.

Większość systemów wychwytu zawiera również receptor pozacytoplazmatyczny, białko wiążące substancję rozpuszczoną. Niektóre homologiczne ATPazy działają w procesach niezwiązanych z transportem, takich jak translacja RNA i naprawa DNA . Transportery ABC są uważane za nadrodzinę ABC w oparciu o podobieństwa sekwencji i organizacji ich domen kasety wiążącej ATP (ABC), chociaż wydaje się , że integralne białka błonowe ewoluowały niezależnie kilka razy, a zatem obejmują różne rodziny białek. Podobnie jak eksporterzy ABC, możliwe jest, że integralne białka błonowe systemów wychwytujących ABC również ewoluowały niezależnie co najmniej 3 razy, w oparciu o ich trójwymiarowe struktury o wysokiej rozdzielczości. Portery wychwytu ABC przyjmują szeroką gamę składników odżywczych, prekursorów biosyntezy, metali śladowych i witamin , podczas gdy eksporterzy transportują lipidy , sterole , leki oraz dużą różnorodność pierwotnych i wtórnych metabolitów. Niektórzy z tych eksporterów u ludzi są zaangażowani w oporność na nowotwory, mukowiscydozę i szereg innych dziedzicznych chorób ludzkich. Wysoki poziom ekspresji genów kodujących niektóre z tych eksporterów zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych (w tym u ludzi) powoduje rozwój oporności na wiele leków, takich jak antybiotyki i środki przeciwnowotworowe.

Setki transporterów ABC zostały scharakteryzowane zarówno z prokariontów, jak i eukariontów. Geny ABC są niezbędne dla wielu procesów w komórce, a mutacje w ludzkich genach powodują lub przyczyniają się do wielu ludzkich chorób genetycznych. U ludzi zgłoszono czterdzieści osiem genów ABC. Wśród nich, wiele z nich zostało scharakteryzowanych i wykazano, że są one związane przyczynowo z chorobami występującymi u ludzi, takimi jak mukowiscydoza , adrenoleukodystrofia , choroba Stargardta , guzy oporne na leki, zespół Dubina-Johnsona , choroba Bylera, postępująca znajoma cholestaza wewnątrzwątrobowa, syderoblastyczny sprzężony z chromosomem X niedokrwistość , ataksja oraz uporczywa hipoglikemia hiperinsulinowa. Transportery ABC są również zaangażowane w wielolekooporność i tak po raz pierwszy zidentyfikowano niektóre z nich. Kiedy białka transportowe ABC ulegają nadekspresji w komórkach rakowych, mogą eksportować leki przeciwnowotworowe i czynić nowotwory opornymi.

Funkcjonować

Transportery ABC wykorzystują energię wiązania i hydrolizy ATP do transportu różnych substratów przez błony komórkowe . Są one podzielone na trzy główne kategorie funkcjonalne. U prokariontów importery pośredniczą w pobieraniu składników odżywczych do komórki. Substraty, które mogą być transportowane, obejmują jony , aminokwasy , peptydy , cukry i inne cząsteczki, które są w większości hydrofilowe . Region obejmujący błonę transportera ABC chroni hydrofilowe substraty przed lipidami dwuwarstwy błony, zapewniając w ten sposób drogę przez błonę komórkową. Eukarionty nie posiadają żadnych importerów. Eksportery lub effluxery , które są obecne zarówno u prokariontów, jak i eukariontów, działają jako pompy, które wypychają toksyny i leki z komórki. W przypadku bakterii Gram-ujemnych eksporterzy transportują lipidy i niektóre polisacharydy z cytoplazmy do peryplazmy . Trzecia podgrupa białek ABC nie działa jako transportery, ale bierze udział w procesach translacji i naprawy DNA.

Prokariotyczny

Bakteryjne transportery ABC są niezbędne dla żywotności komórek, zjadliwości i patogenności. Na przykład systemy pobierania żelaza ABC są ważnymi efektorami zjadliwości. Patogeny wykorzystują siderofory , takie jak enterobaktyna , do usuwania żelaza w kompleksie z białkami wiążącymi żelazo o wysokim powinowactwie lub erytrocytami . Są to cząsteczki chelatujące żelazo o wysokim powinowactwie, które są wydzielane przez bakterie i ponownie absorbują żelazo w kompleksach żelazowo-syderoforowych. ChvE-gguAB genu w Agrobacterium tumefaciens koduje glukozy i galaktozy importerów, są także związane ze zjadliwością. Transportery są niezwykle istotne dla przeżycia komórek, ponieważ działają jako układy białkowe, które przeciwdziałają wszelkim niepożądanym zmianom zachodzącym w komórce. Na przykład potencjalny śmiertelny wzrost siły osmotycznej jest równoważony przez aktywację osmozujących transporterów ABC, które pośredniczą w wychwytywaniu substancji rozpuszczonych. Oprócz funkcjonowania w transporcie, niektóre bakteryjne białka ABC są również zaangażowane w regulację kilku procesów fizjologicznych.

W bakteryjnych systemach wypływu niektóre substancje, które muszą być wytłoczone z komórki, obejmują składniki powierzchniowe komórki bakteryjnej (np. polisacharydy otoczkowe, lipopolisacharydy i kwas techojowy ), białka biorące udział w patogenezie bakterii (np. hemoliza , białko wiążące hem i zasada proteaza ), hem, enzymy hydrolityczne , białka warstwy S, czynniki kompetencji, toksyny , antybiotyki , bakteriocyny , antybiotyki peptydowe , leki i siderofory. Odgrywają również ważną rolę w szlakach biosyntezy, w tym pozakomórkowej biosyntezie polisacharydów i biogenezie cytochromów .

Eukariotyczny

Chociaż większość eukariotycznych transporterów ABC to effluxery, niektóre nie są bezpośrednio zaangażowane w transport substratów. W transbłonowym regulatorze mukowiscydozy ( CFTR ) oraz w receptorze sulfonylomocznika (SUR) hydroliza ATP jest związana z regulacją otwierania i zamykania kanałów jonowych niesionych przez samo białko ABC lub inne białka.

Transportery ludzkiego ABC są zaangażowane w szereg chorób wynikających z polimorfizmów w genach ABC i rzadko z powodu całkowitej utraty funkcji pojedynczych białek ABC. Takie choroby obejmują Mendelian chorób i złożone choroby genetyczne, takie jak mukowiscydoza, adrenoleukodystrofię , chorobę Stargardta , choroba Tanger , niedobory immunologiczne, postępujące rodzinnej intraheptic cholestazy , zespół Dubin-Johnson , pseudoxanthoma elasticum , utrzymujący hiperinsulinemią hipoglikemii niemowlęctwa powodu ogniskowej gruczolakowatą krokowego , X -związanego sideroblastosis niedokrwistość , związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej , rodzinną hypoapoproteinemia, zwyrodnienie siatkówki barwnikowa, stożek pręt dystrofia i inne. Rodzina ludzkich ABCB (MDR/TAP) jest odpowiedzialna za oporność na wiele leków (MDR) na różne strukturalnie niepowiązane leki. Glikoproteina P ABCB1 lub MDR1 jest również zaangażowana w inne procesy biologiczne, w których transport lipidów jest główną funkcją. Stwierdzono, że pośredniczy w wydzielaniu steroidowego aldosteronu przez nadnercza, a jego zahamowanie blokuje migrację dendrytycznych komórek odpornościowych, prawdopodobnie związaną z transportem na zewnątrz lipidowego czynnika aktywującego płytki (PAF). Doniesiono również, że ABCB1 pośredniczy w transporcie kortyzolu i deksametazonu , ale nie progesteronu w komórkach transfekowanych ABCB1. MDR1 może również transportować cholesterol , krótkołańcuchowe i długołańcuchowe analogi fosfatydylocholiny (PC), fosfatydyloetanoloaminy (PE), fosfatydyloseryny (PS), sfingomieliny (SM) i glukozyloceramidu (GlcCer). Wielospecyficzny transport różnych endogennych lipidów przez transporter MDR1 może prawdopodobnie wpływać na rozkład przez dwuwarstwę lipidów, w szczególności gatunków zwykle dominujących na wewnętrznym płatku błony komórkowej, takich jak PS i PE.

Niedawno wykazano, że transportery ABC istnieją w łożysku , co wskazuje, że mogą odgrywać rolę ochronną dla rozwijającego się płodu przed ksenobiotykami .

Struktura

Struktura importera ABC: BtuCD z białkiem wiążącym ( PDB : 2qi9 ​)

Struktura eksportera ABC: Sav1866 ze związanym nukleotydem ( PDB : 2onj ​)

Wszystkie białka transportowe ABC mają wspólną organizację strukturalną składającą się z czterech domen rdzeniowych. Domeny te składają się z dwóch domen transbłonowych (T) i dwóch domen cytozolowych (A). Dwie domeny T zmieniają się między orientacją do wewnątrz i na zewnątrz, a zmiana jest napędzana przez hydrolizę trifosforanu adenozyny lub ATP . ATP wiąże się z podjednostkami A, a następnie jest hydrolizowany, aby zasilić przemianę, ale dokładny proces, w którym to się dzieje, nie jest znany. Cztery domeny mogą być obecne w czterech oddzielnych polipeptydach , które występują głównie w bakteriach, lub są obecne w jednym lub dwóch polipeptydach wielodomenowych . Gdy polipeptydy są jedną domeną, mogą być określane jako pełna domena, a gdy są dwiema wielodomenami, mogą być określane jako połowa domeny. Każda z domen T jest zbudowana z typowo 10 błon obejmujących alfa helisy, przez które transportowana substancja może przejść przez błonę plazmatyczną . Również struktura domen T determinuje specyficzność każdego białka ABC. W konformacji skierowanej do wewnątrz miejsce wiązania w domenie A jest otwarte bezpośrednio na otaczające roztwory wodne. Umożliwia to cząsteczkom hydrofilowym wejście do miejsca wiązania bezpośrednio z wewnętrznego płatka dwuwarstwy fosfolipidowej . Ponadto luka w białku jest dostępna bezpośrednio z hydrofobowego rdzenia wewnętrznego płatka dwuwarstwy błony. Umożliwia to cząsteczkom hydrofobowym wejście do miejsca wiązania bezpośrednio z wewnętrznego płatka dwuwarstwy fosfolipidowej . Po przejściu zasilanego ATP do konformacji skierowanej na zewnątrz, cząsteczki są uwalniane z miejsca wiązania i mogą uciec do płatka egzoplazmatycznego lub bezpośrednio do ośrodka zewnątrzkomórkowego .

Wspólną cechą wszystkich transporterów ABC jest to, że składają się z dwóch odrębnych domen, domeny transbłonowej (TMD) i domeny wiążącej nukleotydy (NBD) . TMD, znana również jako domena obejmująca błonę (MSD) lub domena integralna błona (IM), składa się z alfa helis , osadzonych w dwuwarstwie błony. Rozpoznaje różne substraty i podlega zmianom konformacyjnym w celu transportu substratu przez membranę. Sekwencja i architektura TMD jest zmienna, odzwierciedlając chemiczną różnorodność substratów, które mogą być translokowane. Z drugiej strony domena kasety wiążącej NBD lub ATP (ABC) znajduje się w cytoplazmie i ma wysoce konserwatywną sekwencję. NBD jest miejscem wiązania ATP. U większości eksporterów N-końcowa domena transbłonowa i C-końcowe domeny ABC są połączone w pojedynczy łańcuch polipeptydowy, ułożony jako TMD-NBD-TMD-NBD. Przykładem jest HlyB, eksporter hemolizyny E. coli . Importerzy mają organizację odwróconą, czyli NBD-TMD-NBD-TMD, gdzie domena ABC jest N-końcowa, podczas gdy TMD jest C-końcowa, tak jak w białku MacB E. coli odpowiedzialnym za oporność na makrolidy .

Architektura strukturalna transporterów ABC składa się co najmniej z dwóch TMD i dwóch NBD. Cztery poszczególne łańcuchy polipeptydowe, włącznie z dwoma TMD i dwóch podjednostek NBD, mogą łączyć się, tworząc pełną transporter, na przykład w E. coli importera BtuCD zaangażowanych w wychwytu witaminy B ₁₂ . Większość eksporterami, takie jak na przekazującego wielolekowej Sav1866 ze Staphylococcus aureus , są wykonane z homodimer składa się z dwóch pół transporterów lub monomerów o TMD fuzji do domeny wiązania nukleotydu (NBD). Często do uzyskania funkcjonalności wymagany jest pełny transporter. Niektóre transportery ABC mają dodatkowe elementy, które przyczyniają się do funkcji regulacyjnej tej klasy białek. W szczególności, importerzy mają białko wiążące o wysokim powinowactwie (BP), które specyficznie wiąże się z substratem w peryplazmie w celu dostarczenia do odpowiedniego transportera ABC. Eksportery nie mają białka wiążącego, ale mają domenę wewnątrzkomórkową (ICD), która łączy helisy obejmujące błonę i domenę ABC. Uważa się, że ICD jest odpowiedzialny za komunikację między TMD i NBD.

domena transbłonowa (TMD)

Większość transporterów ma domeny transbłonowe, które składają się w sumie z 12 α-helis z 6 α-helisami na monomer. Ponieważ TMD są strukturalnie zróżnicowane, niektóre transportery mają różną liczbę helis (od sześciu do jedenastu). Domeny TM są podzielone na trzy odrębne zestawów fałdów: typu I ABC importera , typ II ABC importera i ABC eksportera fałd. Klasyfikacja fałd importera opiera się na szczegółowej charakterystyce sekwencji.

Fałd importera ABC typu I był pierwotnie obserwowany w podjednostce ModB TM transportera molibdenianu . Ten fałd diagnostyczny można również znaleźć w podjednostkach MalF i MalG TM MalFGK ₂ i transporterze Met MetI. W transporterze MetI minimalny zestaw 5 helis transbłonowych stanowi tę fałdę, podczas gdy dodatkowa helisa jest obecna zarówno dla ModB, jak i MalG. Wspólną organizacją fałdy jest topologia „góra-dół” helis TM2-5, która wyściela ścieżkę translokacji i helisę TM1 owiniętą wokół zewnętrznej, skierowanej do błony powierzchni i styka się z innymi helisami TM.

Fałdowanie importera ABC typu II obserwuje się w domenie helisy dwudziestu TM BtuCD iw Hi1471, homologicznym transporterze z Haemophilus influenzae . W BtuCD upakowanie helis jest złożone. Zauważalnym wzorem jest to, że helisa TM2 jest umieszczona przez środek podjednostki, gdzie jest otoczona w bliskiej odległości przez inne helisy. Tymczasem helisy TM5 i TM10 są umieszczone w interfejsie TMD. Region obejmujący błonę eksporterów ABC jest zorganizowany w dwa „skrzydła”, które składają się z helis TM1 i TM2 z jednej podjednostki i TM3-6 z drugiej, w układzie z zamienionymi domenami. Istotnym wzorem jest to, że helisy TM1-3 są spokrewnione z TM4-6 przez w przybliżeniu dwukrotny obrót wokół osi w płaszczyźnie błony.

Fałd eksportera jest pierwotnie obserwowany w strukturze Sav1866. Zawiera 12 helis TM, 6 na monomer.

Domena wiążąca nukleotydy (NBD)

Struktura NBD transporterów ABC ze związanym nukleotydem ( PDB : 2onj ). Reprezentacja liniowa sekwencji białkowej powyżej pokazuje względne pozycje konserwatywnych motywów aminokwasowych w strukturze (kolory pasują do struktury 3D)

Domena ABC składa się z dwóch domen, katalitycznej domeny rdzeniowej podobnej do motorycznych ATPaz podobnych do RecA oraz mniejszej, strukturalnie zróżnicowanej subdomeny α-helikalnej, która jest unikalna dla transporterów ABC. Większa domena zazwyczaj składa się z dwóch arkuszy β i sześciu helis α, gdzie katalityczny motyw Walkera A (GXXGXGKS/T, gdzie X oznacza dowolny aminokwas) lub motyw pętli P i Walkera B (ΦΦΦΦD, którego Φ jest resztą hydrofobową ) leży. Domena helikalna składa się z trzech lub czterech helis i motywu sygnatury ABC , znanego również jako motyw LSGGQ , peptyd łącznikowy lub motyw C. Domena ABC zawiera również resztę glutaminy znajdującą się w elastycznej pętli zwanej pętlą Q , pokrywką lub przełącznikiem fosforanu γ, która łączy TMD i ABC. Przypuszcza się, że pętla Q bierze udział w oddziaływaniu NBD i TMD, szczególnie w sprzęganiu hydrolizy nukleotydów ze zmianami konformacyjnymi TMD podczas translokacji substratu. Motyw H lub region przełączający zawiera wysoce konserwatywną resztę histydyny, która jest również ważna w oddziaływaniu domeny ABC z ATP. Nazwa kaseta wiążąca ATP wywodzi się z diagnostycznego rozmieszczenia fałdów lub motywów tej klasy białek po utworzeniu kanapki ATP i hydrolizie ATP.

Wiązanie i hydroliza ATP

Tworzenie dimerów dwóch domen ABC transporterów wymaga wiązania ATP. Ogólnie obserwuje się, że stan związany z ATP jest związany z najbardziej rozległym interfejsem między domenami ABC, podczas gdy struktury transporterów wolnych od nukleotydów wykazują konformacje z większymi rozdzieleniami między domenami ABC. Struktury stanu związanego z ATP izolowanych NBD zostały zgłoszone dla importerów, w tym HisP, GlcV, MJ1267, E. coli MalK (EcMalK), T. litoralis MalK (TlMalK) i eksporterów, takich jak TAP, HlyB, MJ0796, Sav1866, i MSbA. W tych transporterach ATP jest związany z domeną ABC. Dwie cząsteczki ATP znajdują się na granicy dimeru, umieszczone pomiędzy motywem Walkera A jednej podjednostki i motywem LSGGQ drugiej. Po raz pierwszy zaobserwowano to w Rad50 i opisano w strukturach MJ0796, podjednostki NBD transportera LolD z Methanococcus jannaschii i EcMalK transportera maltozy. Struktury te były również zgodne z wynikami badań biochemicznych, które wykazały, że ATP jest w bliskim kontakcie z resztami w motywie pętli P i LSGGQ podczas katalizy .

Wiązanie nukleotydów jest wymagane, aby zapewnić elektrostatyczną i/lub strukturalną integralność miejsca aktywnego i przyczynić się do powstania aktywnego dimeru NBD. Wiązanie ATP jest stabilizowane przez następujące interakcje: (1) wzajemne oddziaływanie pierścienia konserwowanej reszty aromatycznej poprzedzającej motyw A Walkera i pierścienia adenozyny ATP, (2) wiązania wodorowe między konserwowaną resztą lizyny w motywie A Walkera i atomy tlenu β- i γ-fosforanów ATP oraz koordynacja tych fosforanów i niektórych reszt w motywie A Walkera z jonem Mg ²⁺ oraz (3) koordynacja γ-fosforanu z łańcuchem bocznym grup seryny i szkieletowych grup amidowych od glicyny reszt motywu LSGGQ. Ponadto reszta, która sugeruje ścisłe sprzężenie wiązania ATP i dimeryzacji, jest konserwatywną histydyną w pętli H. Ta histydyna kontaktuje się z resztami na granicy faz dimeru w motywie A Walkera i pętli D, sekwencji konserwatywnej następującej po motywie B Walkera.

Hydroliza enzymatyczna ATP wymaga odpowiedniego wiązania fosforanów i umiejscowienia γ-fosforanu w atakującej wodzie. W miejscu wiązania nukleotydów atomy tlenu β- i γ-fosforanów ATP są stabilizowane przez reszty w motywie A Walkera i koordynowane z Mg2 ⁺ . Ten jon Mg ²⁺ koordynuje również z końcową resztą asparaginianową w motywie B Walkera poprzez atakującą H ₂ O. Ogólna zasada, która może być resztą glutaminianu sąsiadującą z motywem B Walkera, glutaminą w pętli Q lub histydynę w rejonie przełącznika, która tworzy wiązanie wodorowe z gamma fosforanowa ATP jest katalizują szybkość hydrolizy ATP poprzez promowanie atakujących * H ₂ O. dokładny mechanizm hydrolizy ATP jest nadal kontrowersyjne.

Mechanizm transportu

Transportery ABC są transporterami aktywnymi , to znaczy wykorzystują energię w postaci trójfosforanu adenozyny (ATP) do przemieszczania substratów przez błony komórkowe. Białka te wykorzystują energię wiązania i/lub hydrolizy ATP do napędzania zmian konformacyjnych w domenie transbłonowej (TMD) i w konsekwencji transportu cząsteczek. Importerzy i eksporterzy ABC mają wspólny mechanizm transportu substratów. Są podobne w swojej strukturze. Model opisujący zmiany konformacyjne związane z wiązaniem substratu to model z dostępem naprzemiennym . W tym modelu miejsce wiązania substratu zmienia się pomiędzy konformacją skierowaną na zewnątrz i do wewnątrz . Względne powinowactwa wiązania dwóch konformacji substratu w dużej mierze determinują kierunek transportu netto. W przypadku importerów, ponieważ translokacja jest skierowana z peryplazmy do cytoplazmy, konformacja skierowana na zewnątrz ma wyższe powinowactwo wiązania z substratem. W przeciwieństwie do tego, powinowactwo wiązania substratu u eksporterów jest większe w konformacji skierowanej do wewnątrz. Model opisujący zmiany konformacyjne w domenie wiążącej nukleotydy (NBD) w wyniku wiązania i hydrolizy ATP to model przełącznika ATP . Model ten ma dwie główne konformacje NBDs: formowanie zamkniętej na dimer dwie cząsteczki wiążące ATP i dysocjacji do dimeru otwartego ułatwione przez hydrolizę ATP i uwalniania nieorganicznego fosforanu (P _I ) i dwufosforanu adenozyny (ADP). Przełączanie między otwartą i zamkniętą konformacją dimeru indukuje zmiany konformacyjne w TMD, powodując translokację substratu.

Ogólny mechanizm cyklu transportowego transporterów ABC nie został w pełni wyjaśniony, ale zgromadzono istotne dane strukturalne i biochemiczne, aby wspierać model, w którym wiązanie i hydroliza ATP są sprzężone ze zmianami konformacyjnymi w transporterze. Stan spoczynku wszystkich transporterów ABC ma NBD w konfiguracji otwartego dimeru, z niskim powinowactwem do ATP. Ta otwarta konformacja posiada komorę dostępną do wnętrza transportera. Cykl transportu jest inicjowany przez wiązanie substratu do miejsca o wysokim powinowactwie na TMD, co indukuje zmiany konformacyjne w NBD i wzmacnia wiązanie ATP. Dwie cząsteczki ATP wiążą się wspólnie, tworząc zamkniętą konfigurację dimeru. Zamknięty dimer NBD indukuje zmianę konformacyjną w TMD tak, że TMD otwiera się, tworząc komorę z otworem przeciwnym do stanu początkowego. Powinowactwo substratu do TMD jest zmniejszone, uwalniając w ten sposób substrat. Hydroliza ATP, a następnie następuje sekwencyjne uwalnianie P _ı i ADP przywraca transporter do konfiguracji podstawowej. Chociaż sugerowano wspólny mechanizm, kolejność wiązania substratu, wiązania nukleotydów i hydrolizy oraz zmian konformacyjnych, jak również interakcji między domenami jest nadal przedmiotem dyskusji.

Kilka grup badających transportery ABC ma odmienne założenia dotyczące siły napędowej funkcji transportera. Ogólnie przyjmuje się, że hydroliza ATP zapewnia główny wkład energii lub „suw mocy” do transportu i że NBD działają naprzemiennie i są prawdopodobnie zaangażowane w różne etapy cyklu transportu. Jednak ostatnie dane strukturalne i biochemiczne pokazują, że wiązanie ATP, a nie hydroliza ATP, zapewnia „udar mocy”. Może być również tak, że skoro wiązanie ATP wyzwala dimeryzację NBD, tworzenie dimeru może reprezentować „udar mocy”. Ponadto niektóre transportery mają NBD, które nie mają podobnych zdolności do wiązania i hydrolizowania ATP, a fakt, że granica faz dimeru NBD składa się z dwóch kieszeni wiążących ATP, sugeruje jednoczesną funkcję dwóch NBD w cyklu transportowym.

Doniesiono o pewnych dowodach na to, że wiązanie ATP jest rzeczywiście skokiem mocy cyklu transportowego. Wykazano, że wiązanie ATP indukuje zmiany we właściwościach TMD wiązania substratu. Powinowactwo transporterów ABC do substratów było trudne do bezpośredniego pomiaru, a pomiary pośrednie, na przykład poprzez stymulację aktywności ATPazy, często odzwierciedlają inne etapy ograniczające szybkość. Ostatnio, bezpośredni pomiar winblastyna wiązania się permeaza -glycoprotein ( glikoproteina P ), w obecności ATP nonhydrolyzable analogów, np 5'-cyklazy-β-γ-imidodiphosphate (AMP-PNP), wykazały, że wiązanie ATP w nieobecności hydroliza wystarcza do zmniejszenia powinowactwa wiązania substratu. Ponadto wiązanie ATP indukuje istotne zmiany konformacyjne w TMD. Badania spektroskopowe , dostępności proteaz i sieciowania wykazały, że wiązanie ATP z NBD indukuje zmiany konformacyjne w białku 1 związanym z opornością na wiele leków (MRP1), HisPMQ, LmrA i Pgp. Dwuwymiarowe struktury krystaliczne Pgp związanych z AMP-PNP wykazały, że główna zmiana konformacyjna podczas cyklu transportu zachodzi po związaniu ATP i że późniejsza hydroliza ATP wprowadza bardziej ograniczone zmiany. Obrót i nachylenie transbłonowych α-helis może przyczyniać się do tych zmian konformacyjnych. Inne badania skupiały się na potwierdzeniu, że wiązanie ATP indukuje tworzenie zamkniętych dimerów NBD. Badania biochemiczne nienaruszonych kompleksów transportowych sugerują, że zmiany konformacyjne w NBD są stosunkowo niewielkie. W przypadku braku ATP, NBD mogą być stosunkowo elastyczne, ale nie pociągają za sobą znacznej reorientacji NBD w stosunku do innych domen. Wiązanie ATP indukuje sztywną rotację ciała dwóch subdomen ABC względem siebie, co pozwala na prawidłowe dopasowanie nukleotydu w miejscu aktywnym i interakcję z wyznaczonymi motywami. Istnieją mocne dowody biochemiczne, że wiązanie dwóch cząsteczek ATP może być kooperatywne, to znaczy ATP musi wiązać się z dwiema kieszeniami miejsca aktywnego, zanim NBD będą mogły dimeryzować i tworzyć zamkniętą, katalitycznie aktywną konformację.

importerzy ABC

Większość transporterów ABC, które pośredniczą w pobieraniu składników odżywczych i innych cząsteczek przez bakterie, opiera się na białku wiążącym substancje rozpuszczone (BP) o wysokim powinowactwie. BP to rozpuszczalne białka zlokalizowane w przestrzeni peryplazmatycznej między błoną wewnętrzną i zewnętrzną bakterii Gram-ujemnych . Mikroorganizmy Gram-dodatnie nie posiadają peryplazmy, tak że ich białko wiążące jest często lipoproteiną związaną z zewnętrzną powierzchnią błony komórkowej . Niektóre bakterie Gram-dodatnie mają BP połączone z domeną transbłonową samego transportera. Pierwszą udaną rentgenowską strukturą krystaliczną nienaruszonego importera ABC jest transporter molibdenu (ModBC-A) z Archaeoglobus fulgidus . Określono również struktury rozdzielczości atomowej trzech innych importerów bakterii, E. coli BtuCD, E. coli transporter maltozy (MalFGK _2- E) i przypuszczalny transporter chelatujący metal Haemophilus influenzae , HI1470/1. Struktury dostarczyły szczegółowych obrazów interakcji domeny transbłonowej i ABC, a także ujawniły dwie różne konformacje z otworem w dwóch przeciwnych kierunkach. Inną wspólną cechą importerów jest to, że każda NBD jest związana z jednym TMD głównie przez krótką helisę cytoplazmatyczną TMD, „helisę sprzęgającą”. Ta część pętli EAA zadokuje w szczelinie powierzchniowej utworzonej między poddomenami ABC podobnymi do RecA i helikalnymi ABC i leży w przybliżeniu równolegle do dwuwarstwy błony.

Duzi importerzy ABC

BtuCD i HI1470/1 są klasyfikowane jako duże (Typ II) importerów ABC. Podjednostka transbłonowa witaminy B ₁₂ importera BtuCD zawiera 10 helisy TM a jednostka funkcjonalna składa się z dwóch egzemplarzach domeny wiązania nukleotydu (NBD) i domeny przezbłonowej (TMD). TMD i NBD oddziałują ze sobą poprzez pętlę cytoplazmatyczną pomiędzy dwiema helisami TM i pętlą Q w ABC. W przypadku braku nukleotydu, dwie domeny ABC są sfałdowane, a interfejs dimeru jest otwarty. Porównanie struktur z białkiem wiążącym (BtuCDF) i bez (BtuCD) ujawnia, że ​​BtuCD ma otwór skierowany w stronę peryplazmy, podczas gdy w BtuCDF konformacja skierowana na zewnątrz jest zamknięta po obu stronach błony. Struktury BtuCD i homolog BtuCD, HI1470/1, reprezentują dwa różne stany konformacyjne transportera ABC. Przewidywany szlak translokacji w BtuCD jest otwarty na peryplazmę i zamknięty po cytoplazmatycznej stronie błony, podczas gdy szlak HI1470/1 jest skierowany w przeciwnym kierunku i otwarty tylko na cytoplazmę. Różnica w strukturach to skręcenie o 9° jednej podjednostki TM względem drugiej.

Mali importerzy ABC

Struktury ModBC-A i MalFGK _2- E, które są w kompleksie z ich białkiem wiążącym, odpowiadają małym (Typ I) importerom ABC. TMD ModBC-A i MalFGK ₂ -E mają tylko sześć helis na podjednostkę. Homodimer ModBC-A jest w konformacji, w której podjednostki TM (ModB) orientują się w odwrócony kształt V z wnęką dostępną dla cytoplazmy. Z drugiej strony, podjednostki ABC (ModC) są ułożone w otwartej, wolnej od nukleotydów konformacji, w której pętla P jednej podjednostki jest zwrócona, ale jest oddzielona od motywu LSGGQ drugiej. Białko wiążące ModA znajduje się w zamkniętej konformacji z substratem związanym w szczelinie pomiędzy jego dwoma płatami i przyłączonym do zewnątrzkomórkowych pętli ModB, przy czym substrat znajduje się bezpośrednio nad zamkniętym wejściem transportera. Struktura MalFGK _2- E przypomina katalityczny stan przejściowy dla hydrolizy ATP. Jest w zamkniętej konformacji, w której zawiera dwie cząsteczki ATP, umieszczone pomiędzy motywami Walkera A i B jednej podjednostki i motywem LSGGQ drugiej podjednostki. Białko wiążące maltozę (MBP lub MalE) jest zadokowane po peryplazmatycznej stronie podjednostek TM (MalF i MalG), a na granicy MalF i MalG można znaleźć dużą, okludowaną wnękę. Układ helis TM jest w konformacji, która jest zamknięta w kierunku cytoplazmy, ale z otworem skierowanym na zewnątrz. Struktura sugeruje możliwość, że MBP może stymulować aktywność ATPazy transportera po związaniu.

Mechanizm transportu dla importerów

Proponowany mechanizm transportu dla importerów ABC. Ten model o zmiennym dostępie został oparty na strukturach krystalicznych ModBC-A i HI1470/1.

Mechanizm transportu dla importerów wspiera model dostępu naprzemiennego. Stan spoczynku importerów jest skierowany do wewnątrz, gdzie interfejs dimeru domeny wiążącej nukleotydy (NBD) jest utrzymywany przez TMD w pozycji otwartej i skierowany na zewnątrz, ale zaokludowany przez cytoplazmę. Po zadokowaniu zamkniętego, obciążonego substratem białka wiążącego w kierunku peryplazmatycznej strony domen transbłonowych, ATP wiąże się i dimer NBD zamyka się. To przełącza stan spoczynku transportera w konformację skierowaną na zewnątrz, w której TMD zmieniły orientację, aby otrzymać substrat z białka wiążącego. Po hydrolizie ATP, dimer NBD otwiera się i substrat jest uwalniany do cytoplazmy. Zwolnić z ADP i P _i powraca transporter do stanu spoczynku. Jedyną niezgodnością tego mechanizmu z modelem przełącznika ATP jest to, że konformacja w stanie spoczynkowym, bez nukleotydów, różni się od oczekiwanej konformacji skierowanej na zewnątrz. Chociaż tak jest, kluczową kwestią jest to, że NBD nie ulega dimeryzacji, chyba że ATP i białko wiążące są związane z transporterem.

Eksporterzy ABC

Eksporterzy prokariotycznego ABC są liczni i mają bliskie homologi u eukariontów. Ta klasa transporterów jest badana w oparciu o rodzaj transportowanego podłoża. Jedna klasa jest zaangażowana w eksport białek (np. toksyn , enzymów hydrolitycznych , białka warstwy S, lantybiotyki , bakteriocyny i czynniki kompetencji), a druga w wypływ leków. Transportery ABC zyskały dużą uwagę, ponieważ przyczyniają się do odporności komórek na antybiotyki i środki przeciwnowotworowe poprzez wypompowywanie leków z komórek. Powszechnym mechanizmem jest nadekspresja eksporterów ABC, takich jak glikoproteina P (P-gp/ABCB1), białko 1 związane z opornością wielolekową ( MRP1 / ABCC1 ) i białko oporności raka piersi (BCRP/ABCG2) w komórkach nowotworowych, które ograniczają ekspozycję do leków przeciwnowotworowych.

W organizmach Gram-ujemnych transportery ABC pośredniczą w sekrecji substratów białkowych jednocześnie przez błony wewnętrzne i zewnętrzne bez przechodzenia przez peryplazmę. Ten typ sekrecji określany jest jako sekrecja typu I , która obejmuje trzy współpracujące ze sobą składniki: eksporter ABC , białko fuzyjne błony (MFP) i czynnik błony zewnętrznej (OMF) . Przykładem jest wydzielanie hemolizyny (HlyA) z E. coli, gdzie transporter ABC błony wewnętrznej HlyB oddziałuje z białkiem fuzyjnym błony wewnętrznej HlyD i czynnikiem ułatwiającym błonę zewnętrzną TolC. TolC umożliwia transport hemolizyny przez dwie błony z pominięciem peryplazmy.

Oporność bakterii na leki staje się coraz większym problemem zdrowotnym. Jeden z mechanizmów lekooporności jest związany ze wzrostem wypływu antybiotyków z komórki bakteryjnej. Oporność na leki związaną z wypływem leku, w której pośredniczy glikoproteina P , została pierwotnie odnotowana w komórkach ssaków. W przypadku bakterii Levy i współpracownicy przedstawili pierwsze dowody na to, że oporność na antybiotyki była spowodowana aktywnym wypływem leku. Glikoproteina P jest najlepiej zbadaną pompą usuwającą substancje z komórki i jako taka dostarczyła ważnych informacji na temat mechanizmu pomp bakteryjnych. Chociaż niektórzy eksporterzy transportują określony rodzaj substratu, większość transporterów wytłacza zróżnicowaną klasę leków o różnej strukturze. Transportery te są powszechnie nazywane transporterami ABC odpornymi na wiele leków (MDR) i czasami określane są jako „odkurzacze hydrofobowe”.

Ludzka glikoproteina P ABCB1/MDR1

Glikoproteina P (3.A.1.201.1) jest dobrze zbadanym białkiem związanym z opornością wielolekową. Należy do ludzkiej rodziny ABCB (MDR/TAP) i jest również znany jako ABCB1 lub MDR1 Pgp . MDR1 składa się z funkcjonalnego monomeru z dwiema domenami transbłonowymi (TMD) i dwiema domenami wiążącymi nukleotydy (NBD). Białko to może transportować głównie substraty kationowe lub elektrycznie obojętne, a także szerokie spektrum substratów amfifilowych. Strukturę pełnowymiarowego monomeru ABCB1 otrzymano w obecności i pod nieobecność nukleotydu metodą kriokrystalografii elektronowej . Bez nukleotydu, TMD są w przybliżeniu równoległe i tworzą baryłkę otaczającą centralny por, z otworem skierowanym w stronę zewnątrzkomórkowej strony błony i zamkniętym na powierzchni wewnątrzkomórkowej. W obecności niehydrolizowalnego analogu ATP, AMP-PNP, TMD mają znaczną reorganizację z trzema wyraźnie oddzielonymi domenami. Centralny por, który jest zamknięty pomiędzy TMD, jest lekko otwarty w kierunku powierzchni wewnątrzkomórkowej z przerwą między dwiema domenami, umożliwiającą dostęp substratu z fazy lipidowej. Znaczne przepakowanie i możliwa rotacja helis TM po związaniu nukleotydów sugeruje model rotacji helisy dla mechanizmu transportu.

Transportery roślin

Genom rośliny modelowej Arabidopsis thaliana jest zdolny do kodowania 120 białek ABC w porównaniu z 50-70 białkami ABC, które są kodowane przez ludzki genom i muszki owocowe ( Drosophila melanogaster ). Roślinne białka ABC są podzielone na 13 podrodzin na podstawie wielkości (pełna, połowa lub ćwiartka), orientacji i ogólnego podobieństwa sekwencji aminokwasów. Homologi wielolekooporne (MDR), znane również jako glikoproteiny P, stanowią największą podrodzinę roślin liczącą 22 członków i drugą co do wielkości ogólną podrodzinę ABC. Podrodzina B roślinnych transporterów ABC (ABCB) charakteryzuje się lokalizacją w błonie komórkowej. Roślinne transportery ABCB charakteryzują się heterologiczną ekspresją w komórkach Escherichia coli , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe (drożdże rozszczepialne) i komórkach HeLa w celu określenia specyficzności substratu. Wykazano, że roślinne transportery ABCB transportują fitohormon kwasu indolo-3-octowego (IAA), znany również jako auksyna , niezbędny regulator wzrostu i rozwoju roślin. Kierunkowy polarny transport auksyny pośredniczy w reakcjach środowiskowych roślin poprzez procesy takie jak fototropizm i grawitropizm. Dwa z najlepiej zbadanych transporterów auksyn, ABCB1 i ABCB19, zostały scharakteryzowane jako pierwszorzędowe eksportery auksyny Inne transportery ABCB, takie jak ABCB4, uczestniczą zarówno w eksporcie, jak i imporcie auksyny Przy niskich stężeniach wewnątrzkomórkowych ABCB4 importuje auksynę aż do osiągnięcia pewnego progu, który następnie odwraca funkcję, aby eksportować tylko auksynę.

Saw1866

Pierwszą strukturą o wysokiej rozdzielczości zgłoszoną dla eksportera ABC była struktura Sav1866 (3.A.1.106.2) ze Staphylococcus aureus . Sav1866 to homolog wielolekowych transporterów ABC. Wykazuje znaczące podobieństwo sekwencji do ludzkich transporterów ABC podrodziny B, która obejmuje MDR1 i TAP1/TAP2. Wiadomo, że aktywność ATPazy Sav1866 jest stymulowana przez leki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna , winblastyna i inne, co sugeruje podobną specyficzność substratową do glikoproteiny P, a zatem możliwy powszechny mechanizm translokacji substratu. Sav1866 jest homodimerem półtransporterów, a każda podjednostka zawiera N-końcową TMD z sześcioma helisami i C-końcową NBD. NBD mają podobną strukturę do innych transporterów ABC, w których dwa miejsca wiązania ATP są utworzone na granicy dimeru między motywem Walkera A jednego NBD a motywem LSGGQ drugiego. Struktura Sav1866 związana z ADP pokazuje NBD w zamkniętym dimerze, a helisy TM dzielą się na dwa „skrzydła” zorientowane w kierunku peryplazmy, tworząc konformację skierowaną na zewnątrz. Każde skrzydło składa się z helis TM1-2 z jednej podjednostki i TM3-6 z drugiej podjednostki. Zawiera długie pętle wewnątrzkomórkowe (ICL lub ICD) łączące TMD, które rozciągają się poza dwuwarstwę lipidową do cytoplazmy i oddziałują z 8=D. Podczas gdy importerzy zawierają krótką helisę sprzęgającą, która styka się z pojedynczą NBD, Sav1866 ma dwie wewnątrzkomórkowe helisy sprzęgające, jedną (ICL1) stykającą się z NBD obu podjednostek, a drugą (ICL2) oddziałującą tylko z przeciwną podjednostką NBD.

MsbA

MsbA (3.A.1.106.1) jest wielolekoopornym (MDR) transporterem ABC i prawdopodobnie flippazą lipidową . Jest to ATP - aza, która transportuje lipid A , hydrofobowe ugrupowanie lipopolisacharydu (LPS), sacharolipidu opartego na glukozaminie, który stanowi zewnętrzną monowarstwę błon zewnętrznych większości bakterii gram-ujemnych. Lipid A jest endotoksyną, a zatem utrata MsbA z błony komórkowej lub mutacje zakłócające transport skutkują akumulacją lipidu A w wewnętrznej błonie komórkowej, co prowadzi do śmierci komórki. Jest bliskim homologiem bakteryjnym glikoproteiny P (Pgp) pod względem homologii sekwencji białka i ma nakładającą się specyficzność substratową z transporterem MDR-ABC LmrA z Lactococcus lactis . Narzędzie MBSA z E. coli wynosi 36% identyczna z NH ₂ -końcową połowę ludzkiej MDR1, co wskazuje na wspólny mechanizm transportu substratów amfipatyczny i hydrofobowych. Gen MsbA koduje połowę transportera, który zawiera domenę transbłonową (TMD) połączoną z domeną wiążącą nukleotydy (NBD). Jest składany jako homodimer o całkowitej masie cząsteczkowej 129,2 kD. MsbA zawiera 6 TMD po stronie peryplazmatycznej, NBD położoną po cytoplazmatycznej stronie błony komórkowej oraz domenę wewnątrzkomórkową (ICD), łączącą TMD i NBD. Ta konserwatywna helisa rozciągająca się od segmentów TMD do lub w pobliżu miejsca aktywnego NBD jest w dużej mierze odpowiedzialna za przesłuch między TMD i NBD. W szczególności ICD1 służy jako zachowana oś, wokół której NBD może się obracać, umożliwiając w ten sposób dysocjację i dimeryzację NBD podczas wiązania i hydrolizy ATP.

Struktury MsbA przedstawiające trzy stany konformacyjne: otwarte apo ( PDB : 3b5w ​), zamknięte apo ( PDB : 3b5x ​) i związane z nukleotydami ( PDB : 3b60 ​)

Wcześniej opublikowane (i obecnie wycofane) struktury rentgenowskie MsbA były niezgodne z homologiem bakteryjnym Sav1866. Struktury zostały ponownie zbadane i stwierdzono, że mają błąd w przypisaniu ręki wynikający z nieprawidłowych modeli MsbA. Ostatnio błędy zostały naprawione i zgłoszono nowe struktury. Stan spoczynku E. coli MsbA wykazuje kształt odwróconego „V” z komorą dostępną do wnętrza transportera, co sugeruje otwartą, skierowaną do wewnątrz konformację . Kontakty dimerów są skoncentrowane między pętlami zewnątrzkomórkowymi i podczas gdy NBD są oddalone od siebie o ~50Å, podjednostki są skierowane do siebie. Odległość między pozostałościami w miejscu styku dimeru została zweryfikowana przez eksperymenty sieciowania i badania spektroskopowe EPR . Stosunkowo duża komora pozwala na umieszczenie dużych grup główek, takich jak te obecne w lipidzie A. Do przemieszczenia dużych grup główek cukru przez błonę wymagane są znaczne zmiany konformacyjne. Różnica między dwiema strukturami wolnymi od nukleotydów (apo) polega na odchyleniu około 30° helis TM4/TM5 w stosunku do helis TM3/TM6. W stanie zamkniętym apo (od V. cholerae MsbA), NBD są wyrównane i chociaż są bliżej, nie utworzyły kanapki ATP, a pętle P przeciwnych monomerów są umieszczone obok siebie. W porównaniu z konformacją otwartą, interfejs dimeru TMD w konformacji zamkniętej, skierowanej do wewnątrz ma rozległe styki. Dla obu konformacji apo MsbA otwór komory jest skierowany do wewnątrz. Struktura MsbA-AMP-PNP (5'-adenylilo-β-γ-imidodifosforanu) otrzymanego z S. typhimurium jest podobna do Sav1866. NBD w tej związanej z nukleotydem, skierowanej na zewnątrz konformacji łączą się, tworząc kanoniczną kanapkę z dimerem ATP, to znaczy nukleotyd znajduje się pomiędzy pętlą P i motywem LSGGQ. Przejście konformacyjne z MsbA-closed-apo do MsbA-AMP-PNP obejmuje dwa etapy, które są bardziej prawdopodobne: obrót helis TM4/TM5 o 10° w kierunku TM3/TM6, przybliżający NBD, ale nie do wyrównania, a następnie wychylenie spiral TM4/TM5 ≈20° poza płaszczyznę. Ruch skręcający powoduje oddzielenie helis TM3/TM6 od TM1/TM2 prowadząc do zmiany konformacji do wewnątrz na zwróconą na zewnątrz. Tak więc zmiany zarówno w orientacji, jak i rozstawieniu NBD radykalnie zmieniają upakowanie helis transbłonowych i skutecznie przełączają dostęp do komory z wewnętrznego na zewnętrzny płatek błony. Struktury wyznaczone dla MsbA stanowią podstawę do przechylnego modelu transportu. Opisane struktury podkreślają również dynamiczny charakter eksporterów ABC, co sugerują również badania fluorescencyjne i EPR. Ostatnie prace zaowocowały odkryciem inhibitorów MsbA.

Mechanizm transportu dla eksporterów

Proponowany mechanizm transportu dla eksporterów ABC. Model ten został oparty na badaniach strukturalnych i biochemicznych MsbA.

Eksporterzy ABC mają mechanizm transportu zgodny zarówno z modelem dostępu naprzemiennego, jak i modelem przełącznika ATP. W stanach apo eksporterów konformacja jest skierowana do wewnątrz, a TMD i NBD są stosunkowo daleko od siebie, aby pomieścić amfifilowe lub hydrofobowe substraty. Zwłaszcza w przypadku MsbA wielkość komory jest wystarczająco duża, aby pomieścić grupy cukrowe z lipopolisacharydów (LPS). Jak sugerowało kilka grup, wiązanie substratu inicjuje cykl transportu. „Udar mocy”, to znaczy wiązanie ATP, które indukuje dimeryzację NBD i tworzenie kanapki ATP, napędza zmiany konformacyjne w TMD. W MsbA grupy główek cukru są odseparowywane w komorze podczas „udaru mocy”. Wnęka jest wyłożona naładowanymi i polarnymi resztami, które prawdopodobnie są solwatowane, tworząc energetycznie niekorzystne środowisko dla hydrofobowych substratów i energetycznie korzystne dla ugrupowań polarnych w związkach amfifilowych lub grupach cukrowych z LPS. Ponieważ lipid nie może być stabilny przez długi czas w środowisku komory, lipid A i inne cząsteczki hydrofobowe mogą „przerzucić się” do bardziej korzystnej energetycznie pozycji w obrębie zewnętrznego płatka błony. „Odwrócenie” może być również spowodowane ścinaniem sztywnego korpusu TMD, podczas gdy hydrofobowe ogony LPS są przeciągane przez podwójną warstwę lipidową. Ponowne upakowanie helis przełącza konformację do stanu skierowanego na zewnątrz. Hydroliza ATP może poszerzyć otwór peryplazmatyczny i popchnąć substrat w kierunku zewnętrznego płatka dwuwarstwy lipidowej. Hydroliza cząsteczki drugiego ATP i uwalniania P _i oddziela NBDs następnie przywrócenie stanu spoczynkowego otwierania komory do cytoplazmy na kolejny cykl.

Rola w wielolekooporności

Wiadomo, że transportery ABC odgrywają kluczową rolę w rozwoju oporności wielolekowej (MDR). W MDR pacjenci przyjmujący leki ostatecznie rozwijają oporność nie tylko na lek, który przyjmują, ale także na kilka różnych rodzajów leków. Jest to spowodowane kilkoma czynnikami, z których jednym jest zwiększone wydalanie leku z komórki przez transportery ABC. Na przykład białko ABCB1 ( glikoproteina P ) działa w pompowaniu leków hamujących nowotwór z komórki. Pgp zwany także MDR1, ABCB1, jest prototypem transporterów ABC, a także najszerzej zbadanym genem. Wiadomo, że Pgp transportuje organiczne związki kationowe lub obojętne. Kilku członków rodziny ABCC, znanych również jako MRP, również nadaje MDR organicznym związkom anionowym. Najbardziej przebadanym członkiem rodziny ABCG jest ABCG2, znany również jako BCRP (białko oporności raka piersi) nadający oporność na większość inhibitorów topoizomerazy I lub II, takich jak topotekan, irinotekan i doksorubicyna.

Nie jest jasne, w jaki sposób białka te mogą przenosić tak szeroką gamę leków, jednak jeden model (odkurzacz hydrofobowy) stwierdza, że ​​w glikoproteinie P leki są wiązane bezkrytycznie z fazy lipidowej na podstawie ich hydrofobowości.

Odkrycie pierwszego eukariotycznego białka transportowego ABC pochodziło z badań nad komórkami nowotworowymi i hodowanymi komórkami, które wykazywały oporność na kilka leków o niepowiązanych strukturach chemicznych. Wykazano, że komórki te wyrażają podwyższone poziomy białka transportującego oporność wielolekową (MDR), które pierwotnie nazywano glikoproteiną P (P-gp), ale jest również określane jako białko oporności wielolekowej 1 (MDR1) lub ABCB1. Białko to wykorzystuje hydrolizę ATP , podobnie jak inne transportery ABC, do eksportu wielu różnych leków z cytozolu do ośrodka zewnątrzkomórkowego. W komórkach wielolekoopornych gen MDR1 jest często amplifikowany. Powoduje to dużą nadprodukcję białka MDR1. Substraty ssaczego ABCB1 to przede wszystkim płaskie, rozpuszczalne w tłuszczach cząsteczki z jednym lub większą liczbą ładunków dodatnich. Wszystkie te substraty konkurują ze sobą o transport, co sugeruje, że wiążą się z tymi samymi lub nakładającymi się miejscami na białku. Wiele leków transportowanych przez ABCB1 to małe, niepolarne leki, które dyfundują przez środowisko zewnątrzkomórkowe do cytozolu, gdzie blokują różne funkcje komórkowe. Leki takie jak kolchicyna i winblastyna , które blokują tworzenie mikrotubul, swobodnie przenikają przez błonę do cytozolu, ale eksport tych leków przez ABCB1 zmniejsza ich stężenie w komórce. Dlatego do zabicia komórek wykazujących ekspresję ABCB1 wymagane jest wyższe stężenie leków niż te, które nie wykazują ekspresji genu.

Inne transportery ABC, które przyczyniają się do oporności wielolekowej to ABCC1 (MRP1) i ABCG2 (białko oporności raka piersi).

Aby rozwiązać problemy związane z wielolekową opornością MDR1, można stosować różne rodzaje leków lub należy zahamować transportery ABC. Aby inne rodzaje leków działały, muszą ominąć mechanizm oporności, którym jest transporter ABC . W tym celu można zastosować inne leki przeciwnowotworowe, takie jak leki alkilujące ( cyklofosfamid ), antymetabolity ( 5-fluorouracyl ) oraz leki modyfikowane antracykliną ( peptyd annamycyna i doksorubicyna ). Leki te nie działałyby jako substrat transporterów ABC, a zatem nie byłyby transportowane. Inną opcją jest jednoczesne stosowanie kombinacji leków hamujących ABC i leków przeciwnowotworowych. To odwróciłoby oporność na leki przeciwnowotworowe, aby mogły działać zgodnie z przeznaczeniem. Substraty, które odwracają oporność na leki przeciwnowotworowe, nazywane są chemosensybilizatorami.

Odwrócenie wielolekooporności

Oporność na leki jest powszechnym problemem klinicznym, który występuje u pacjentów cierpiących na choroby zakaźne oraz u pacjentów cierpiących na raka. Często okazuje się, że mikroorganizmy prokariotyczne i eukariotyczne oraz komórki nowotworowe są oporne na leki. MDR jest często związany z nadekspresją transporterów ABC. Hamowanie transporterów ABC przez związki o małej masie cząsteczkowej było szeroko badane u pacjentów z rakiem; jednak wyniki kliniczne były rozczarowujące. Ostatnio zastosowano różne strategie RNAi do odwrócenia MDR w różnych modelach nowotworów i ta technologia jest skuteczna w odwracaniu MDR za pośrednictwem transportera ABC w komórkach rakowych, a zatem jest obiecującą strategią przezwyciężania MDR przez zastosowania terapii genowej. Można również rozważyć technologię RNAi w celu przezwyciężenia MDR w chorobach zakaźnych wywoływanych przez patogeny drobnoustrojowe.

Rola fizjologiczna

Oprócz przekazywania MDR w komórkach nowotworowych, transportery ABC ulegają również ekspresji w błonach zdrowych komórek, gdzie ułatwiają transport różnych substancji endogennych, a także substancji obcych dla organizmu. Na przykład transportery ABC, takie jak Pgp, MRP i BCRP, ograniczają wchłanianie wielu leków z jelita i pompują leki z komórek wątroby do żółci w celu usunięcia obcych substancji z organizmu. Duża liczba leków jest albo transportowana przez same transportery ABC, albo wpływa na transport innych leków. Ten ostatni scenariusz może prowadzić do interakcji między lekami , czasami skutkujących zmienionymi skutkami leków.

Metody charakteryzowania interakcji transportera ABC

Istnieje wiele rodzajów testów, które umożliwiają wykrycie interakcji transportera ABC ze związkami endogennymi i ksenobiotycznymi. Złożoność testu waha się od stosunkowo prostych testów membranowych. jak test transportu pęcherzykowego, test ATPazy do bardziej złożonych testów opartych na komórkach aż do skomplikowanych testów in vivo Jeffrey P, Summerfield SG (2007). „Wyzwania przesiewowe bariery krew-mózg (BBB)”. Ksenobiotyka . 37 (10-11): 1135-51. doi : 10.1080/00498250701570285 . PMID  17968740 . S2CID  25944548 . metodologie wykrywania.

Testy błonowe

Pęcherzykowej oznaczeń transportu wykrywa przemieszczenie cząsteczek przez transportery ABC. Błony przygotowane w odpowiednich warunkach zawierają pęcherzyki zorientowane do wewnątrz z miejscem wiązania ATP i miejscem wiązania substratu transportera zwróconym ku buforowi na zewnątrz. Substraty transportera są pobierane do pęcherzyków w sposób zależny od ATP. Do oddzielenia pęcherzyków od roztworu inkubacyjnego stosuje się szybką filtrację z użyciem filtrów z włókna szklanego lub membran nitrocelulozowych, a badany związek uwięziony wewnątrz pęcherzyków jest zatrzymywany na filtrze. Ilość transportowanych nieznakowanych cząsteczek jest określana za pomocą HPLC, LC/MS, LC/MS/MS. Alternatywnie, związki są znakowane radioaktywnie, fluorescencyjne lub mają znacznik fluorescencyjny, tak aby można było określić ilościowo radioaktywność lub fluorescencję zatrzymaną na filtrze.

W badaniach transportu pęcherzykowego stosuje się różne typy błon z różnych źródeł (np. komórki owadów, transfekowane lub wybrane linie komórek ssaków). Błony są dostępne w handlu lub można je wytworzyć z różnych komórek lub nawet tkanek, np. błon kanalikowych wątroby. Ten typ testu ma zaletę mierzenia rzeczywistego rozmieszczenia substratu w błonie komórkowej. Jego wadą jest to, że związki o średniej do wysokiej przepuszczalności biernej nie są zatrzymywane wewnątrz pęcherzyków, co utrudnia bezpośrednie pomiary transportu z tą klasą związków.

Test transportu pęcherzykowego można przeprowadzić w ustawieniu „pośrednim”, gdzie oddziałujące badane leki modulują szybkość transportu związku reporterowego. Ten typ testu jest szczególnie odpowiedni do wykrywania możliwych interakcji lek-lek i interakcji lek-endogenny substrat. Nie jest wrażliwy na bierną przepuszczalność związków i dlatego wykrywa wszystkie wchodzące w interakcje związki. Jednak nie dostarcza informacji, czy badany związek jest inhibitorem transportera, czy substratem transportera hamującym jego funkcję w sposób konkurencyjny. Typowym przykładem testu pośredniego transportu pęcherzykowego jest wykrywanie hamowania transportu taurocholanu przez ABCB11 ( BSEP ).

Testy oparte na całych komórkach

Komórki z ekspresją transportera wypływu aktywnie wypompowują substraty z komórki, co skutkuje niższym tempem akumulacji substratu, niższym stężeniem wewnątrzkomórkowym w stanie stacjonarnym lub szybszym tempem eliminacji substratu z komórek obciążonych substratem. Transportowane substraty radioaktywne lub znakowane barwniki fluorescencyjne można zmierzyć bezpośrednio lub w pośrednim ustawieniu, modulację akumulacji substratu sondy (np. barwników fluorescencyjnych, takich jak rodamina 123 lub kalceina) można określić w obecności badanego leku.

Calcein-AM, wysoce przepuszczalna pochodna kalceiny łatwo przenika do nienaruszonych komórek, gdzie endogenne esterazy szybko hydrolizują ją do fluorescencyjnej kalceiny. W przeciwieństwie do kalceiny-AM, kalceina ma niską przepuszczalność i dlatego zostaje uwięziona w komórce i kumuluje się. Ponieważ kalceina-AM jest doskonałym substratem transporterów wypływowych MDR1 i MRP1, komórki eksprymujące transportery MDR1 i/lub MRP1 wypompowują kalceinę-AM z komórki, zanim esterazy będą mogły ją zhydrolizować. Skutkuje to niższym tempem akumulacji kalceiny w komórkach. Im wyższa aktywność MDR w błonie komórkowej, tym mniej kalceiny gromadzi się w cytoplazmie. W komórkach wykazujących ekspresję MDR, dodanie w nadmiarze inhibitora MDR lub substratu MDR dramatycznie zwiększa szybkość akumulacji kalceiny. Aktywność transportera wielolekowego odzwierciedla różnica pomiędzy ilością barwnika akumulowanego w obecności i braku inhibitora. Stosując selektywne inhibitory, można łatwo rozróżnić aktywność transportową MDR1 i MRP1. Test ten można stosować do badania przesiewowego leków pod kątem interakcji z transporterem, a także do ilościowego określania aktywności MDR komórek. Test na kalceinę jest zastrzeżonym testem firmy SOLVO Biotechnology.

Podrodziny

Podrodziny ssaków

Istnieje 49 znanych transporterów ABC obecnych u ludzi, które zostały zaklasyfikowane do siedmiu rodzin przez Human Genome Organization.

Pełną listę ludzkich transporterów ABC można znaleźć od.

ABCA

Podrodzina ABCA składa się z 12 pełnych transporterów podzielonych na dwie podgrupy. Pierwsza podgrupa składa się z siedmiu genów, które mapują sześć różnych chromosomów . Są ABCA1 , ABCA2 , abca3 i ABCA4 , ABCA7 , ABCA12 i abca13 . Druga podgrupa składa się z ABCA5 i ABCA6 i ABCA8 , ABCA9 i ABCA10 . A8-10. Cała podgrupa 2 jest zorganizowana w skupisko chromosomów od głowy do ogona na chromosomie 17q 24. Geny w tej drugiej podgrupie różnią się od genów podobnych do ABCA1 tym, że mają 37-38 egzonów w przeciwieństwie do 50 egzonów w ABCA1. Podgrupa ABCA1 bierze udział w rozwoju chorób genetycznych. W recesywnej chorobie Tangera białko ABCA1 jest zmutowane. Ponadto ABCA4 mapuje region chromosomu 1p21, który zawiera gen choroby Stargardta. Stwierdzono, że gen ten jest silnie eksprymowany w fotoreceptorach pręcików i jest zmutowany w chorobie Stargardta, recesywnym barwnikowym zapaleniu siatkówki i większości recesywnych dystrofii czopków i pręcików.

ABCB

Podrodzina ABCB składa się z czterech pełnych transporterów i dwóch połówkowych transporterów. Jest to jedyna ludzka podrodzina, w której występują zarówno połowiczne, jak i pełne typy transporterów. ABCB1 odkryto jako białko nadekspresjonowane w pewnych lekoopornych komórkach nowotworowych. Jest wyrażany głównie w barierze krew-mózg i wątrobie i uważa się, że bierze udział w ochronie komórek przed toksynami. Komórki z nadekspresją tego białka wykazują oporność wielolekową .

ABCC

Podrodzina ABCC zawiera trzynastu członków, a dziewięć z tych transporterów określa się jako białka oporności wielolekowej (MRP). Białka MRP występują w naturze i pośredniczą w wielu ważnych funkcjach. Wiadomo, że biorą udział w transporcie jonów, wydzielaniu toksyn i przekazywaniu sygnału. Spośród dziewięciu białek MRP cztery z nich, MRP4, 5, 8, 9 (ABCC4, 5, 11 i 12), mają typową strukturę ABC z czterema domenami, składającymi się z dwóch domen obejmujących błonę, z których każda obejmuje domena wiążąca nukleotydy. Są one określane jako krótkie MRP. Pozostałe 5 MRP (MRP1, 2, 6, 7 (ABCC1, 2, 3, 6 i 10) są znane jako długie MRP i zawierają dodatkową piątą domenę na ich N-końcu.

CFTR , transporter biorący udział w chorobie mukowiscydozy , jest również uważany za część tej podrodziny. Mukowiscydoza występuje po mutacji i utracie funkcji CFTR.

Do receptorów sulfonylomocznika (SUR) , biorące udział w wydzielaniu insuliny, funkcji neuronalnej i funkcji mięśni są częścią tej rodziny białek. Mutacje w białkach SUR są potencjalną przyczyną cukrzycy noworodkowej . SUR jest również miejscem wiązania leków, takich jak pochodne sulfonylomocznika i aktywatory otwierające kanały potasowe, takie jak diazoksyd .

ABCD

Podrodzina ABCD składa się z czterech genów kodujących połówki transporterów eksprymowanych wyłącznie w peroksysomach . ABCD1 jest odpowiedzialna za formę adrenoleukodystrofii sprzężonej z chromosomem X (ALD), która jest chorobą charakteryzującą się neurodegeneracją i niedoborem nadnerczy, która zazwyczaj rozpoczyna się w późnym dzieciństwie. Komórki pacjentów z ALD cechują się akumulacją nierozgałęzionych nasyconych kwasów tłuszczowych, ale dokładna rola ABCD1 w tym procesie nie została jeszcze ustalona. Ponadto funkcja innych genów ABCD nie została jeszcze określona, ​​ale uważa się, że mają one podobne funkcje w metabolizmie kwasów tłuszczowych .

ABCE i ABCF

Obie te podgrupy składają się z genów, które mają domeny wiążące ATP, które są blisko spokrewnione z innymi transporterami ABC, ale te geny nie kodują domen transbłonowych. ABCE składa się tylko z jednego członka, OABP lub ABCE1 , o którym wiadomo, że rozpoznaje pewne oligodendrocyty wytwarzane w odpowiedzi na pewne infekcje wirusowe. Każdy członek podgrupy ABCF składa się z pary domen wiążących ATP.

ABCG

Sześć połówek transporterów z miejscami wiązania ATP na końcu N i domenami transbłonowymi na końcu C tworzy podrodzinę ABCG. Ta orientacja jest przeciwieństwem wszystkich innych genów ABC. W ludzkim genomie jest tylko 5 genów ABCG, ale jest ich 15 w genomie Drosophila i 10 w drożdżach. Gen ABCG2 został odkryty w liniach komórkowych wyselekcjonowanych pod kątem wysokiego poziomu oporności na mitoksantron i braku ekspresji ABCB1 lub ABCC1 . ABCG2 może eksportować antrocyklinowe leki przeciwnowotworowe, a także topotekan , mitoksantron lub doksorubicynę jako substraty. Stwierdzono, że translokacje chromosomów powodują amplifikację lub rearanżację ABCG2 występującą w opornych liniach komórkowych. Normalna funkcja ABCG2 nie jest znana.

Podrodziny międzygatunkowe

W TCDB skonstruowano następujący system klasyfikacji transbłonowych transporterów substancji rozpuszczonych.

Trzy rodziny eksporterów ABC są definiowane przez ich ewolucyjne pochodzenie. Eksportery ABC1 wyewoluowały przez wewnątrzgenowe potrojenie prekursora 2 TMS (TMS = segment transbłonowy. Białko „2 TMS” ma 2 segmenty transbłonowe) dając 6 białek TMS. Eksporterzy ABC2 wyewoluowali przez wewnątrzgenową duplikację prekursora 3 TMS, a eksporterzy ABC3 wyewoluowali z prekursora 4 TMS, który duplikował się albo pozagenowo, aby otrzymać dwa białka 4 TMS, oba wymagane do funkcji transportowej, albo wewnątrzgenowo, aby otrzymać 8 lub 10 białek TMS. Wydaje się, że 10 białek TMS ma dwa dodatkowe TMS pomiędzy dwoma jednostkami powtórzeń 4 TMS. Większość systemów pobierania (wszystkie z wyjątkiem 3.A.1.21) jest typu ABC2, podzielonego na typ I i ​​typ II ze względu na sposób, w jaki radzą sobie z nukleotydami. Specjalna podrodzina importerów ABC2 zwana ECF używa oddzielnej podjednostki do rozpoznawania substratów.

ABC1 ( InterPro :  IPR036640 ):

ABC2 ( InterPro :  IPR000412 [częściowy]):

ABC3 ( InterPro :  IPR003838 ):

Zobacz białka należące do ABC Superfamily : tutaj

Obrazy

W ostatnich latach wytworzono wiele struktur rozpuszczalnych w wodzie domen białek ABC.

Zobacz też

• Domena wiążąca ATP transporterów ABC
• Domena transbłonowa transporterów ABC
• Elizabeth P. Carpenter , brytyjska biolog strukturalny, jako pierwsza opisała strukturę ludzkiego transportera ABC ABC10

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki

• Klasyfikacja transporterów ABC w TCDB
• ABCdb Baza danych Archaeal and Bacterial ABC Systems, ABCdb
• ATP-Binding + kaseta + transportery w Narodowej Bibliotece Medycznej USA Medical Subject Headings (MeSH)