Proteomika - Proteomics

Proteomika to szeroko zakrojone badanie białek . Białka są niezbędnymi częściami żywych organizmów, pełniącymi wiele funkcji. Proteom jest cały zestaw białek wytwarzane lub modyfikowane przez organizm lub systemu. Proteomika umożliwia identyfikację coraz większej liczby białek. Zależy to od czasu i różnych wymagań lub stresów, którym poddawana jest komórka lub organizm. Proteomika to interdyscyplinarna dziedzina, która wiele skorzystała z informacji genetycznej różnych projektów genomicznych , w tym Human Genome Project . Obejmuje badanie proteomów z ogólnego poziomu składu, struktury i aktywności białek i jest ważnym elementem genomiki funkcjonalnej .

Proteomika ogólnie odnosi się do wielkoskalowej analizy eksperymentalnej białek i proteomów, ale często odnosi się konkretnie do oczyszczania białek i spektrometrii mas .

Historia i etymologia

Pierwsze badania białek, które można uznać za proteomikę, rozpoczęto w 1975 roku, po wprowadzeniu dwuwymiarowego żelu i mapowaniu białek z bakterii Escherichia coli .

Proteome to połączenie słów „białko” i „genom”. Został wymyślony w 1994 roku przez ówczesnego doktoranta Marca Wilkinsa na Macquarie University , który założył pierwsze dedykowane laboratorium proteomiczne w 1995 roku.

Złożoność problemu

Po genomice i transkryptomice proteomika jest kolejnym krokiem w badaniu systemów biologicznych. Jest to bardziej skomplikowane niż genomika, ponieważ genom organizmu jest mniej więcej stały, podczas gdy proteomy różnią się w zależności od komórki i od czasu do czasu. Odrębne geny ulegają ekspresji w różnych typach komórek, co oznacza, że ​​trzeba zidentyfikować nawet podstawowy zestaw białek wytwarzanych w komórce.

W przeszłości zjawisko to oceniano za pomocą analizy RNA, w której stwierdzono brak korelacji z zawartością białka. Obecnie wiadomo, że mRNA nie zawsze ulega translacji na białko, a ilość białka wytworzonego dla danej ilości mRNA zależy od genu, z którego jest transkrybowany, oraz od stanu fizjologicznego komórki. Proteomika potwierdza obecność białka i zapewnia bezpośredni pomiar jego ilości.

Modyfikacje potranslacyjne

Translacja z mRNA nie tylko powoduje różnice, ale wiele białek po translacji jest również poddawanych szerokiej gamie modyfikacji chemicznych. Najczęstsze i szeroko badane modyfikacje potranslacyjne obejmują fosforylację i glikozylację. Wiele z tych modyfikacji potranslacyjnych ma kluczowe znaczenie dla funkcji białka.

Fosforylacja

Jedną z takich modyfikacji jest fosforylacja , która dzieje się z wieloma enzymami i białkami strukturalnymi w procesie sygnalizacji komórkowej . Dodanie kwasu fosforowego do poszczególnych aminokwasów, najczęściej seryny i treoniny pośredniczy serynowo-treoninowych kinaz , lub rzadziej tyrozynowej pośredniczy tyrozynowych kinaz -causes białko stać się celem do wiązania lub interakcji z wyraźnych innych białek rozpoznać domenę fosforylowaną.

Ponieważ fosforylacja białek jest jedną z najlepiej zbadanych modyfikacji białek, wiele „proteomicznych” wysiłków jest ukierunkowanych na określenie zestawu fosforylowanych białek w określonej komórce lub typie tkanki w określonych warunkach. To ostrzega naukowca o ścieżkach sygnalizacyjnych, które mogą być aktywne w tym przypadku.

Ubikwitynacja

Ubikwityna jest małym białkiem, które może być przyłączone do pewnych substratów białkowych przez enzymy zwane ligazami ubikwityny E3 . Ustalenie, które białka są poliubikwitynowane, pomaga zrozumieć, w jaki sposób regulowane są szlaki białkowe. Jest to zatem dodatkowe uzasadnione badanie „proteomiczne”. Podobnie, gdy badacz określi, które substraty są ubikwitynowane przez każdą ligazę, pomocne jest określenie zestawu ligaz wyrażanych w konkretnym typie komórek.

Dodatkowe modyfikacje

Oprócz fosforylacji i ubikwitynacji białka mogą być poddawane m.in. metylacji , acetylacji , glikozylacji , utlenianiu i nitrozylacji . Niektóre białka przechodzą wszystkie te modyfikacje, często w kombinacjach zależnych od czasu. To ilustruje potencjalną złożoność badania struktury i funkcji białek.

Wyraźne białka powstają w różnych warunkach

Komórka może wytwarzać różne zestawy białek w różnym czasie lub w różnych warunkach, na przykład podczas rozwoju , różnicowania komórkowego , cyklu komórkowego lub karcynogenezy . Jak wspomniano, przy dalszym zwiększaniu złożoności proteomu większość białek może podlegać szerokiemu zakresowi modyfikacji potranslacyjnych.

Dlatego badanie „proteomiczne” może bardzo szybko stać się złożone, nawet jeśli temat badań jest ograniczony. W bardziej ambitnych warunkach, takich jak poszukiwanie biomarkera dla określonego podtypu raka, naukowiec zajmujący się proteomią może zdecydować się na badanie wielu próbek surowicy krwi od wielu pacjentów z rakiem, aby zminimalizować czynniki zakłócające i uwzględnić szum eksperymentalny. Dlatego czasami konieczne są skomplikowane projekty eksperymentalne, aby uwzględnić dynamiczną złożoność proteomu.

Ograniczenia badań genomicznych i proteomicznych

Proteomika daje inny poziom zrozumienia niż genomika z wielu powodów:

• poziom transkrypcji genu daje jedynie przybliżone oszacowanie jego poziomu translacji na białko. MRNA produkowany w dużych ilościach może być szybko degradowane lub tłumaczyć nieefektywny, w wyniku małej ilości białka.
• jak wspomniano powyżej, wiele białek doświadcza modyfikacji potranslacyjnych, które głęboko wpływają na ich aktywność; na przykład niektóre białka nie są aktywne, dopóki nie zostaną ufosforylowane. Metody takie jak fosfoproteomika i glikoproteomika są wykorzystywane do badania modyfikacji potranslacyjnych.
• wiele transkryptów daje początek więcej niż jednemu białku, poprzez alternatywny splicing lub alternatywne modyfikacje potranslacyjne.
• wiele białek tworzy kompleksy z innymi białkami lub cząsteczkami RNA i działa tylko w obecności tych innych cząsteczek.
• Szybkość degradacji białka odgrywa ważną rolę w zawartości białka.

Powtarzalność . Jednym z głównych czynników wpływających na powtarzalność w eksperymentach proteomicznych jest równoczesna elucja znacznie większej liczby peptydów, niż są w stanie zmierzyć spektrometry masowe. Powoduje to stochastyczne różnice między eksperymentami z powodu zależnego od danych pozyskiwania peptydów trypsynowych. Chociaż wczesne wielkoskalowe analizy proteomiczne shotgun wykazały znaczną zmienność między laboratoriami, prawdopodobnie częściowo ze względu na różnice techniczne i eksperymentalne między laboratoriami, odtwarzalność została poprawiona w nowszych analizach spektrometrii mas, szczególnie na poziomie białka i przy użyciu spektrometrów masowych Orbitrap. Warto zauważyć, że ukierunkowana proteomika wykazuje zwiększoną odtwarzalność i powtarzalność w porównaniu z metodami typu shotgun, jednak kosztem gęstości danych i skuteczności.

Metody badania białek

W proteomice istnieje wiele metod badania białek. Ogólnie rzecz biorąc, białka można wykryć za pomocą przeciwciał (testy immunologiczne) lub spektrometrii masowej . Jeśli analizowana jest złożona próbka biologiczna, przed etapem wykrywania należy użyć bardzo specyficznego przeciwciała w ilościowej analizie dot blot (QDB) lub separacji biochemicznej, ponieważ w próbce jest zbyt wiele analitów, aby można je było przeprowadzić. dokładne wykrywanie i oznaczanie ilościowe.

Wykrywanie białek za pomocą przeciwciał (testy immunologiczne)

Przeciwciała przeciwko określonym białkom lub ich zmodyfikowanym formom były wykorzystywane w badaniach biochemicznych i biologii komórki . Są to jedne z najpowszechniejszych narzędzi używanych obecnie przez biologów molekularnych. Istnieje kilka specyficznych technik i protokołów, które wykorzystują przeciwciała do wykrywania białek. Enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA), nie był stosowany przez dziesięciolecia do wykrywania i ilościowego białka w próbkach pomiarowych. Analizy Western można stosować do wykrywania i ilościowego oznaczania poszczególnych białek, w którym w początkowym etapie powstaje złożona mieszanina białkowy rozdzielano stosując SDS-PAGE i białka będącego przedmiotem zainteresowania jest określona przy użyciu przeciwciała.

Zmodyfikowane białka można badać przez opracowanie przeciwciała specyficznego dla tej modyfikacji. Na przykład, istnieją przeciwciała, które rozpoznają pewne białka tylko wtedy, gdy są ufosforylowane tyrozyną , są one znane jako przeciwciała fosfospecyficzne. Istnieją również przeciwciała specyficzne dla innych modyfikacji. Można je wykorzystać do określenia zestawu białek, które przeszły modyfikację będącą przedmiotem zainteresowania.

Testy immunologiczne można również przeprowadzić przy użyciu wytworzonych rekombinacyjnie pochodnych immunoglobulin lub syntetycznie zaprojektowanych rusztowań białkowych, które są wybrane pod kątem wysokiej specyficzności antygenowej. Takie środki wiążące obejmują jednodomenowe fragmenty przeciwciał (Nanobodies), zaprojektowane białka z powtórzeniami ankyrynowymi (DARPins) i aptamery.

Wykrywanie chorób na poziomie molekularnym napędza nadchodzącą rewolucję wczesnej diagnostyki i leczenia. Wyzwaniem w tej dziedzinie jest to, że biomarkery białkowe do wczesnej diagnozy mogą być obecne w bardzo małej ilości. Dolna granica wykrywalności przy użyciu konwencjonalnej technologii testów immunologicznych to górny zakres femtomoli ( ^10-13 M). Technologii cyfrowej immunologiczny poprawiła czułość wykrywania trzy rejestry, do zakresu attomolar (10 ^-16 M). Ta zdolność ma potencjał, aby otworzyć nowe postępy w diagnostyce i terapii, ale takie technologie zostały zepchnięte do procedur manualnych, które nie są dobrze przystosowane do wydajnego rutynowego stosowania.

Wykrywanie białek bez przeciwciał

Podczas gdy wykrywanie białek za pomocą przeciwciał jest nadal bardzo powszechne w biologii molekularnej, opracowano również inne metody, które nie opierają się na przeciwciele. Metody te oferują różne zalety, na przykład często są w stanie określić sekwencję białka lub peptydu, mogą mieć większą przepustowość niż oparte na przeciwciałach, a czasami mogą identyfikować i oznaczać ilościowo białka, dla których nie istnieje przeciwciało.

Metody wykrywania

Jedną z najwcześniejszych metod analizy białek jest degradacja Edmana (wprowadzona w 1967), w której pojedynczy peptyd jest poddawany wielu etapom chemicznej degradacji w celu rozłożenia jego sekwencji. Te wczesne metody zostały w większości wyparte przez technologie oferujące wyższą przepustowość.

Niedawno wdrożone metody wykorzystują techniki oparte na spektrometrii mas , co stało się możliwe dzięki odkryciu metod „miękkiej jonizacji” opracowanych w latach 80., takich jak desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) i jonizacja elektrorozpylania (ESI) . Metody te dały początek odgórnym i oddolnym przepływom pracy proteomiki, w których przed analizą często przeprowadzana jest dodatkowa separacja (patrz poniżej).

Metody separacji

Do analizy złożonych próbek biologicznych wymagana jest redukcja złożoności próbki. Może to być wykonywane w trybie off-line przez jednowymiarowe lub dwuwymiarowe rozdzielenie. Niedawno opracowano metody on-line, w których poszczególne peptydy (w podejściach proteomiki oddolnej) są rozdzielane przy użyciu chromatografii z odwróconą fazą, a następnie bezpośrednio jonizowane przy użyciu ESI ; bezpośrednie połączenie separacji i analizy wyjaśnia pojęcie analizy „on-line”.

Technologie hybrydowe

Istnieje kilka technologii hybrydowych, które wykorzystują oczyszczanie poszczególnych analitów na podstawie przeciwciał, a następnie przeprowadzają analizę spektrometrii masowej w celu identyfikacji i oceny ilościowej. Przykładami tych metod są: MSIA (mass spectrometric immunoassay) opracowany przez Randalla Nelsona w 1995 roku oraz metoda SISCAPA (Stable Isotope Standard Capture with Anti-Peptide Antibodies) wprowadzona przez Leigh Andersona w 2004 roku.

Aktualne metodologie badawcze

Fluorescencyjna dwuwymiarowa różnicowa elektroforeza żelowa (2-D DIGE) może być wykorzystana do ilościowego określenia zmienności w procesie 2-D DIGE i ustalenia statystycznie ważnych progów przypisywania zmian ilościowych między próbkami.

Porównawcza analiza proteomiczna może ujawnić rolę białek w złożonych układach biologicznych, w tym w reprodukcji. Na przykład, leczenie z triazofosu owadobójczych powoduje wzrost zawartości brązowego planthopper ( Nilaparvata lugens (Stal)) męska akcesoriów gruczołu białka (ACP), które mogą być przeniesione do kobiet za pomocą krzyżowania, co powoduje wzrost płodności (tj wskaźnik urodzeń) kobiet. Aby zidentyfikować zmiany w typach białek gruczołów pomocniczych (Acps) i białek reprodukcyjnych, które kojarzyły się z samicami skoczków, które otrzymały od samców, naukowcy przeprowadzili porównawczą analizę proteomiczną sparowanych samic N. lugens . Wyniki wskazują, że białka te uczestniczą w procesie reprodukcji dorosłych samic i samców N. lugens .

Analiza proteomu peroksysomów Arabidopsis została uznana za główne bezstronne podejście do identyfikacji nowych białek peroksysomów na dużą skalę.

Istnieje wiele podejść do scharakteryzowania ludzkiego proteomu, który, jak się szacuje, zawiera od 20 000 do 25 000 niepotrzebnych białek. Liczba unikalnych gatunków białek prawdopodobnie wzrośnie o od 50 000 do 500 000 z powodu splicingu RNA i zdarzeń proteolizy, a gdy rozważy się również modyfikację potranslacyjną, szacuje się, że całkowita liczba unikalnych ludzkich białek waha się w milionach.

Ponadto ostatnio doniesiono o pierwszych obiecujących próbach rozszyfrowania proteomu guzów zwierzęcych. Metodę tę zastosowano jako metodę funkcjonalną w profilowaniu białek Macrobrachium rosenbergii .

Wysokowydajne technologie proteomiczne

Proteomika stale nabierała rozpędu w ciągu ostatniej dekady dzięki ewolucji kilku podejść. Niewiele z nich jest nowych, a inne opierają się na tradycyjnych metodach. Metody oparte na spektrometrii mas i mikromacierze są najpowszechniejszymi technologiami badania białek na dużą skalę.

Spektrometria mas i profilowanie białek

Obecnie do profilowania białek stosuje się dwie metody oparte na spektrometrii mas. Bardziej ugruntowana i rozpowszechniona metoda wykorzystuje wysokorozdzielczą, dwuwymiarową elektroforezę do równoległego oddzielania białek od różnych próbek, a następnie selekcję i barwienie białek o zróżnicowanej ekspresji, które mają być identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Pomimo postępów w 2-DE i jego dojrzałości, ma również swoje ograniczenia. Głównym problemem jest niezdolność do rozróżnienia wszystkich białek w próbce, biorąc pod uwagę ich dramatyczny zakres poziomu ekspresji i różne właściwości.

Drugie podejście ilościowe wykorzystuje stabilne znaczniki izotopowe do zróżnicowanego znakowania białek z dwóch różnych złożonych mieszanin. Tutaj białka w złożonej mieszaninie są najpierw znakowane izotopowo, a następnie trawione w celu uzyskania znakowanych peptydów. Znakowane mieszaniny są następnie łączone, peptydy rozdzielane za pomocą wielowymiarowej chromatografii cieczowej i analizowane za pomocą tandemowej spektrometrii masowej. Odczynniki Isotope Coded Affinity Tag (ICAT) są szeroko stosowanymi znacznikami izotopowymi. W tej metodzie reszty cysteinowe białek przyłączają się kowalencyjnie do odczynnika ICAT, zmniejszając w ten sposób złożoność mieszanin z pominięciem reszt niecysteinowych.

Proteomika ilościowa wykorzystująca stabilne znakowanie izotopowe jest coraz bardziej użytecznym narzędziem we współczesnym rozwoju. Po pierwsze, zastosowano reakcje chemiczne do wprowadzenia znaczników do określonych miejsc lub białek w celu zbadania określonych funkcji białek. Izolację fosforylowanych peptydów osiągnięto za pomocą znakowania izotopowego i selektywnej chemii w celu wychwycenia frakcji białka w złożonej mieszaninie. Po drugie, technologia ICAT została wykorzystana do rozróżnienia między częściowo oczyszczonymi lub oczyszczonymi kompleksami makrocząsteczkowymi, takimi jak kompleks preinicjacyjny dużej polimerazy RNA II, od białek skompleksowanych z drożdżowym czynnikiem transkrypcyjnym. Po trzecie, znakowanie ICAT połączono ostatnio z izolacją chromatyny w celu identyfikacji i ilościowej oceny białek związanych z chromatyną. Wreszcie odczynniki ICAT są przydatne do profilowania proteomicznego organelli komórkowych i określonych frakcji komórkowych.

Innym podejściem ilościowym jest metoda dokładnego znacznika masy i czasu (AMT) opracowana przez Richarda D. Smitha i współpracowników z Pacific Northwest National Laboratory . W tym podejściu, zwiększoną przepustowość i czułość osiąga się poprzez uniknięcie potrzeby tandemowej spektrometrii mas i wykorzystanie precyzyjnie określonych informacji o czasie rozdziału oraz bardzo dokładnych oznaczeń masy do identyfikacji peptydów i białek.

Ulepszona spektrometria mas fragmentacji w źródle

Udoskonalona spektrometria mas z fragmentacją w źródle, jako alternatywa dla proteomiki opartej na tandemowej spektrometrii mas, została wykazana do identyfikacji białek, charakteryzowania PTM i oznaczania ilościowego (za pomocą Q-MRM).

Chipsy białkowe

Równoważeniem wykorzystania spektrometrów mas w proteomice i medycynie jest zastosowanie mikromacierzy białkowych. Celem mikromacierzy białkowych jest wydrukowanie tysięcy funkcji wykrywania białek do badania próbek biologicznych. Macierze przeciwciał są przykładem, w którym szereg różnych przeciwciał jest ułożonych w macierz w celu wykrycia ich odpowiednich antygenów z próbki krwi ludzkiej. Innym podejściem jest zestawienie wielu typów białek do badania właściwości, takich jak interakcje białko-DNA, białko-białko i białko-ligand. Idealnie, funkcjonalne macierze proteomiczne zawierałyby cały zestaw białek danego organizmu. Pierwsza wersja takich macierzy składała się z 5000 oczyszczonych białek z drożdży osadzonych na szkiełkach mikroskopowych. Pomimo sukcesu pierwszego chipa, wdrożenie macierzy białkowych było większym wyzwaniem. Praca z białkami jest z natury znacznie trudniejsza niż z DNA. Mają szeroki zakres dynamiczny, są mniej stabilne niż DNA, a ich struktura jest trudna do zachowania na szkiełkach, chociaż są one niezbędne w większości testów. Globalna technologia ICAT ma uderzającą przewagę nad technologiami chipów białkowych.

Mikromacierze białek z odwróconą fazą

Jest to obiecująca i nowsza aplikacja mikromacierzy do diagnozowania, badania i leczenia złożonych chorób, takich jak rak. Technologia ta łączy mikrodysekcję z wychwytywaniem laserowym (LCM) z technologią mikromacierzy w celu wytworzenia mikromacierzy białkowych z odwróconą fazą. W tego typu mikromacierzach cały zbiór samych białek jest unieruchamiany z zamiarem uchwycenia różnych stadiów choroby u pojedynczego pacjenta. W przypadku stosowania z LCM macierze odwróconej fazy mogą monitorować zmienny stan proteomu wśród różnych populacji komórek na niewielkim obszarze tkanki ludzkiej. Jest to przydatne do profilowania stanu komórkowych cząsteczek sygnałowych w przekroju tkanki, który obejmuje zarówno komórki prawidłowe, jak i rakowe. To podejście jest przydatne w monitorowaniu stanu kluczowych czynników w prawidłowym nabłonku prostaty i tkankach inwazyjnego raka prostaty. Następnie LCM przecina te tkanki i lizaty białkowe ułożone na szkiełkach nitrocelulozowych, które sondowano specyficznymi przeciwciałami. Ta metoda może śledzić wszelkiego rodzaju zdarzenia molekularne i porównywać chore i zdrowe tkanki u tego samego pacjenta, umożliwiając opracowanie strategii leczenia i diagnozy. Możliwość uzyskania proteomicznych migawek sąsiednich populacji komórek przy użyciu mikromacierzy z odwróconą fazą w połączeniu z LCM ma wiele zastosowań poza badaniem nowotworów. Podejście to może zapewnić wgląd w prawidłową fizjologię i patologię wszystkich tkanek i jest nieocenione w charakteryzowaniu procesów rozwojowych i anomalii.

Praktyczne zastosowania

Odkrycie nowych leków

Jednym z głównych postępów, jaki wyniknie z badań nad ludzkimi genami i białkami, jest identyfikacja potencjalnych nowych leków do leczenia chorób. Opiera się to na informacjach o genomie i proteomie w celu identyfikacji białek związanych z chorobą, które oprogramowanie komputerowe może następnie wykorzystać jako cele dla nowych leków. Na przykład, jeśli pewne białko jest zaangażowane w chorobę, jego trójwymiarowa struktura dostarcza informacji do projektowania leków, które zakłócają działanie białka. Cząsteczka, która pasuje do aktywnego miejsca enzymu, ale nie może być przez enzym uwolniona, inaktywuje enzym. Stanowi to podstawę nowych narzędzi do odkrywania leków, których celem jest znalezienie nowych leków dezaktywujących białka zaangażowane w chorobę. W związku z odkryciem różnic genetycznych między osobnikami naukowcy spodziewają się wykorzystać te techniki do opracowania spersonalizowanych leków, które są bardziej skuteczne dla danej osoby.

Proteomika jest również wykorzystywana do ujawniania złożonych interakcji roślina-owad, które pomagają zidentyfikować geny kandydujące zaangażowane w reakcję obronną roślin na roślinożerność.

Proteomika interakcji i sieci białkowe

Proteomika interakcji to analiza interakcji białek od skali interakcji binarnych do proteomu lub całej sieci. Większość białek działać przez interakcje białko-białko , a jednym celem proteomiki interakcji jest zidentyfikować interakcje białka binarnych , kompleksy białek oraz interactomes .

Dostępnych jest kilka metod sondowania interakcji białko-białko . Podczas gdy najbardziej tradycyjną metodą jest analiza dwuhybrydowa drożdży , potężną, pojawiającą się metodą jest oczyszczanie metodą powinowactwa, a następnie spektrometria masowa białek przy użyciu znakowanych przynęt białkowych . Inne metody obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), mikromacierze białkowe , interferometrię z podwójną polaryzacją , termoforezę w mikroskali oraz metody eksperymentalne, takie jak prezentacja fagowa i metody obliczeniowe in silico .

Wiedza o oddziaływaniach białko-białko jest szczególnie przydatna w odniesieniu do sieci biologicznych i biologii systemów , na przykład w kaskadach sygnalizacji komórkowej i sieciach regulacji genów (GRN, gdzie wiedza o oddziaływaniach białko-DNA jest również pouczająca). Analiza interakcji białek obejmujących cały proteom oraz integracja tych wzorców interakcji z większymi sieciami biologicznymi ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii na poziomie systemów .

Proteomika ekspresji

Proteomika ekspresji obejmuje analizę ekspresji białek na większą skalę. Pomaga zidentyfikować główne białka w konkretnej próbce oraz te białka, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w powiązanych próbkach — takich jak tkanka chora i zdrowa. Jeśli białko zostanie znalezione tylko w chorej próbce, może być użytecznym celem leku lub markerem diagnostycznym. Białka o takich samych lub podobnych profilach ekspresji mogą również być funkcjonalnie spokrewnione. Istnieją technologie, takie jak 2D-PAGE i spektrometria mas, które są wykorzystywane w proteomice ekspresji.

Biomarkery

National Institutes of Health zdefiniowała biomarkera jako „cechy, którą można obiektywnie zmierzyć i ocenić jako wskaźnik normalnych procesów biologicznych, procesów patogennych lub odpowiedzi farmakologicznych na interwencję terapeutyczną.”

Zrozumienie proteomu, struktury i funkcji każdego białka oraz złożoności interakcji białko-białko ma kluczowe znaczenie dla opracowania najskuteczniejszych technik diagnostycznych i leczenia chorób w przyszłości. Na przykład proteomika jest bardzo przydatna w identyfikacji kandydatów na biomarkery (białka w płynach ustrojowych, które mają wartość diagnostyczną), identyfikacji antygenów bakteryjnych będących celem odpowiedzi immunologicznej oraz identyfikacji możliwych markerów immunohistochemicznych chorób zakaźnych lub nowotworowych .

Ciekawym zastosowaniem proteomiki jest wykorzystanie specyficznych biomarkerów białkowych do diagnozowania choroby. Szereg technik pozwala na badanie białek wytwarzanych podczas konkretnej choroby, co pomaga szybko zdiagnozować chorobę. Techniki obejmują western blot , barwienie immunohistochemiczne , test immunoenzymatyczny (ELISA) lub spektrometrię mas . Secretomics , poddziedzina proteomiki, która bada sekrecyjne białka i szlaki sekrecyjne przy użyciu metod proteomicznych, okazała się ostatnio ważnym narzędziem do odkrywania biomarkerów choroby.

Proteogenomika

W proteogenomice technologie proteomiczne , takie jak spektrometria mas , są wykorzystywane do ulepszania adnotacji genów . Równoległa analiza genomu i proteomu ułatwia odkrycie modyfikacji potranslacyjnych i zdarzeń proteolitycznych, zwłaszcza przy porównywaniu wielu gatunków (proteogenomika porównawcza).

proteomika strukturalna

Proteomika strukturalna obejmuje analizę struktur białkowych na dużą skalę. Porównuje struktury białek i pomaga zidentyfikować funkcje nowo odkrytych genów. Analiza strukturalna pomaga również zrozumieć, gdzie leki wiążą się z białkami, a także pokazuje, gdzie białka wchodzą ze sobą w interakcje. Zrozumienie to osiąga się przy użyciu różnych technologii, takich jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia NMR.

Bioinformatyka dla proteomiki (informatyka proteomiczna)

Wiele danych proteomicznych jest gromadzonych za pomocą technologii o wysokiej przepustowości, takich jak spektrometria mas i mikromacierze. Przeanalizowanie danych i ręczne przeprowadzenie porównań często zajęłoby tygodnie lub miesiące. Z tego powodu biolodzy i chemicy współpracują z informatykami i matematykami, aby stworzyć programy i potok do obliczeniowej analizy danych białkowych. Wykorzystując techniki bioinformatyczne , naukowcy są w stanie szybciej analizować i przechowywać dane. Dobrym miejscem do znalezienia list aktualnych programów i baz danych jest portal zasobów bioinformatycznych ExPASy . Zastosowania proteomiki opartej na bioinformatyce obejmują medycynę, diagnostykę chorób, identyfikację biomarkerów i wiele innych.

Identyfikacja białek

Spektrometria mas i mikromacierz dostarczają informacji o fragmentacji peptydów, ale nie umożliwiają identyfikacji konkretnych białek obecnych w oryginalnej próbce. Ze względu na brak specyficznej identyfikacji białek, dawni badacze byli zmuszeni rozszyfrować same fragmenty peptydów. Jednak obecnie dostępne są programy do identyfikacji białek. Programy te pobierają sekwencje peptydowe ze spektrometrii mas i mikromacierzy i zwracają informacje o dopasowanych lub podobnych białkach. Odbywa się to za pomocą algorytmów zaimplementowanych przez program, które dokonują dopasowania do białek ze znanych baz danych, takich jak UniProt i PROSITE, w celu przewidzenia, jakie białka znajdują się w próbce z pewnym stopniem pewności.

Struktura białka

Struktura biomolekularna tworzy konfigurację 3D białka. Zrozumienie struktury białka pomaga w identyfikacji interakcji i funkcji białka. Kiedyś było tak, że trójwymiarową strukturę białek można było określić jedynie za pomocą krystalografii rentgenowskiej i spektroskopii NMR . Od 2017 r. mikroskopia krioelektronowa jest wiodącą techniką, rozwiązującą trudności z krystalizacją (w krystalografii rentgenowskiej) i niejednoznacznością konformacyjną (w NMR); rozdzielczość wynosiła 2,2Å na rok 2015. Obecnie, dzięki bioinformatyce, istnieją programy komputerowe, które mogą w niektórych przypadkach przewidywać i modelować strukturę białek. Programy te wykorzystują właściwości chemiczne aminokwasów i właściwości strukturalne znanych białek do przewidywania modelu 3D próbek białek. Pozwala to również naukowcom modelować interakcje białkowe na większą skalę. Ponadto inżynierowie biomedyczni opracowują metody uwzględniania elastyczności struktur białkowych w celu dokonywania porównań i prognoz.

Modyfikacje potranslacyjne

Większość programów dostępnych do analizy białek nie jest napisana dla białek, które przeszły potranslacyjne modyfikacje . Niektóre programy akceptują modyfikacje potranslacyjne, aby pomóc w identyfikacji białka, ale następnie ignorują modyfikacje podczas dalszej analizy białka. Ważne jest, aby uwzględnić te modyfikacje, ponieważ mogą one wpływać na strukturę białka. Z kolei analiza obliczeniowa modyfikacji potranslacyjnych zwróciła uwagę społeczności naukowej. Obecne programy modyfikacji potranslacyjnych mają charakter jedynie predykcyjny. Chemicy, biolodzy i informatycy pracują wspólnie nad stworzeniem i wprowadzeniem nowych potoków, które pozwolą na analizę modyfikacji potranslacyjnych, które zostały eksperymentalnie zidentyfikowane pod kątem ich wpływu na strukturę i funkcję białka.

Metody obliczeniowe w badaniu biomarkerów białkowych

Jednym z przykładów wykorzystania bioinformatyki i wykorzystania metod obliczeniowych jest badanie biomarkerów białkowych. Obliczeniowe modele predykcyjne wykazały, że rozległy i zróżnicowany transport białek płodowo-matczynych występuje w czasie ciąży i może być łatwo wykryty w sposób nieinwazyjny w pełnej krwi matki. To podejście obliczeniowe pozwoliło ominąć główne ograniczenie, jakim jest obfitość białek matczynych, które przeszkadzają w wykrywaniu białek płodowych , w płodowej analizie proteomicznej krwi matki. Modele obliczeniowe mogą wykorzystywać transkrypty genów płodowych zidentyfikowane wcześniej w pełnej krwi matki w celu stworzenia kompleksowej sieci proteomicznej terminu „ noworodek” . Takie prace pokazują, że białka płodowe wykryte we krwi ciężarnej pochodzą z zróżnicowanej grupy tkanek i narządów rozwijającego się płodu. Sieci proteomiczne zawierają wiele biomarkerów, które są odpowiednikami dla rozwoju i ilustrują potencjalne zastosowanie kliniczne tej technologii jako sposobu monitorowania prawidłowego i nieprawidłowego rozwoju płodu.

Wprowadzono również ramy teorii informacji do odkrywania biomarkerów , integrując informacje o biopłynie i tkankach. To nowe podejście wykorzystuje funkcjonalną synergię między niektórymi biopłynami i tkankami, z możliwością uzyskania istotnych klinicznie wyników, które nie są możliwe, gdyby tkanki i biopłyny były rozpatrywane indywidualnie. Poprzez konceptualizację biopłynów tkankowych jako kanałów informacyjnych, można zidentyfikować istotne wskaźniki pośredniczące biopłynów, a następnie wykorzystać je do ukierunkowanego rozwoju diagnostyki klinicznej. Biomarkery kandydujące są następnie przewidywane na podstawie kryteriów przekazywania informacji przez kanały tkankowo-biofluidowe. Znaczące relacje biopłyn-tkanka można wykorzystać do ustalenia priorytetów klinicznej walidacji biomarkerów.

Wschodzące trendy

Szereg pojawiających się koncepcji może poprawić obecne cechy proteomiki. Uzyskanie bezwzględnej oceny ilościowej białek i monitorowanie modyfikacji potranslacyjnych to dwa zadania, które mają wpływ na zrozumienie funkcji białek w zdrowych i chorych komórkach. W przypadku wielu zdarzeń komórkowych stężenia białek nie zmieniają się; ich funkcja jest raczej modulowana przez modyfikacje potranslacyjne (PTM). Metody monitorowania PTM są obszarem słabo rozwiniętym w proteomice. Wybór konkretnego podzbioru białek do analizy znacznie zmniejsza złożoność białka, co czyni go korzystnym do celów diagnostycznych, gdzie materiałem wyjściowym jest krew. Innym ważnym aspektem proteomiki, który nie został jeszcze poruszony, jest to, że metody proteomiki powinny koncentrować się na badaniu białek w kontekście środowiska. Coraz częstsze stosowanie chemicznych środków sieciujących, wprowadzanych do żywych komórek w celu utrwalenia interakcji białko-białko, białko-DNA i innych, może częściowo złagodzić ten problem. Wyzwaniem jest zidentyfikowanie odpowiednich metod zachowania odpowiednich interakcji. Innym celem badania białek jest opracowanie bardziej wyrafinowanych metod obrazowania białek i innych molekuł w żywych komórkach w czasie rzeczywistym.

Biologia systemów

Postępy w proteomice ilościowej wyraźnie umożliwiłyby bardziej dogłębną analizę systemów komórkowych. Systemy biologiczne są przedmiotem różnych zaburzeń ( cyklu komórkowego , różnicowaniu komórek , karcynogenezie , środowisko (biofizycznych) , itp). Reakcje transkrypcyjne i translacyjne na te perturbacje skutkują zmianami funkcjonalnymi proteomu związanego z odpowiedzią na bodziec. Dlatego opisywanie i ilościowe określanie zmian w obfitości białek w całym proteomie ma kluczowe znaczenie dla bardziej holistycznego zrozumienia zjawiska biologicznego na poziomie całego systemu. W ten sposób proteomika może być postrzegana jako komplementarna do genomiki , transkryptomiki , epigenomiki , metabolomiki i innych podejść -omicznych w analizach integracyjnych próbujących bardziej kompleksowo zdefiniować fenotypy biologiczne . Jako przykład, The Cancer Proteome Atlas dostarcza ilościowych danych dotyczących ekspresji białek dla ~200 białek w ponad 4000 próbek guzów z dopasowanymi danymi transkryptomicznymi i genomowymi z The Cancer Genome Atlas . Podobne zestawy danych w innych typach komórek, rodzajów tkanek i gatunków, w szczególności z wykorzystaniem spektrometrii masowej głęboki strzelba, będzie niezmiernie ważnym źródłem do badań w takich dziedzinach jak biologii nowotworów , rozwojowych i Stem Cell biologii, medycyny i biologii ewolucyjnej .

Proteom ludzkiego osocza

Scharakteryzowanie proteomu ludzkiego osocza stało się głównym celem na arenie proteomicznej, ale jest to również najtrudniejsze proteomy wszystkich ludzkich tkanek. Zawiera immunoglobuliny, cytokiny, hormony białkowe i białka wydzielnicze wskazujące na infekcję na szczycie rezydentnych białek hemostatycznych. Zawiera również białka przecieku tkankowego z powodu krążenia krwi przez różne tkanki w ciele. Krew zawiera zatem informacje o stanie fizjologicznym wszystkich tkanek i w połączeniu z jej dostępnością sprawia, że ​​proteom krwi jest nieoceniony w celach medycznych. Uważa się, że scharakteryzowanie proteomu osocza krwi jest trudnym wyzwaniem.

Głębokość proteomu osocza obejmująca dynamiczny zakres ponad 10 ¹⁰ pomiędzy białkiem o największej obfitości (albumina) a najmniejszą (niektóre cytokiny) i jest uważana za jedno z głównych wyzwań dla proteomiki. Dynamika czasowa i przestrzenna dodatkowo komplikuje badanie proteomu ludzkiego osocza. Obrót niektórych białek jest znacznie szybszy niż innych, a zawartość białka w tętnicy może znacznie różnić się od zawartości białka w żyle. Wszystkie te różnice sprawiają, że nawet najprostsze proteomiczne zadanie skatalogowania proteomu wydaje się być poza zasięgiem. Aby rozwiązać ten problem, należy ustalić priorytety. Jednym z takich priorytetów jest uchwycenie najbardziej znaczącego podzbioru białek z całego proteomu w celu wygenerowania narzędzia diagnostycznego. Po drugie, ponieważ nowotwór wiąże się ze zwiększoną glikozylacją białek, przydatne będą również metody skupiające się na tej części białek. Ponownie: analiza wieloparametrowa najlepiej ujawnia stan patologiczny. W miarę ulepszania tych technologii profile chorób powinny być stale powiązane ze zmianami w ekspresji odpowiednich genów. Ze względu na wyżej wymienione problemy proteomika osocza pozostawała wyzwaniem. Jednak postęp technologiczny i ciągły rozwój wydają się skutkować ożywieniem proteomiki osocza, jak pokazała niedawno technologia zwana profilowaniem proteomu osocza. Dzięki takim technologiom naukowcy byli w stanie zbadać procesy zapalne u myszy, dziedziczność proteomów osocza, a także wykazać wpływ tak powszechnej zmiany stylu życia, jak utrata masy ciała, na proteom osocza.

Czasopisma

Liczne czasopisma poświęcone są proteomice i dziedzinom pokrewnym. Należy zauważyć, że czasopisma zajmujące się białkami zwykle bardziej koncentrują się na strukturze i funkcji, podczas gdy czasopisma proteomiczne koncentrują się bardziej na analizie na dużą skalę całych proteomów lub przynajmniej dużych zestawów białek. Niektóre z ważniejszych są wymienione poniżej (wraz z ich wydawcami).

• Proteomika molekularna i komórkowa ( ASBMB )
• Journal of Proteome Research ( ACS )
• Dziennik Proteomiki ( Elsevier )
• Proteomika ( Wiley )

Zobacz też

Bazy białek

Ośrodki badawcze

• Europejski Instytut Bioinformatyki
• Holenderskie Centrum Proteomiki (NPC)

Bibliografia

Bibliografia

Zewnętrzne linki

• Proteomika w Curlie