Inżynieria kofaktorów - Cofactor engineering

Inżynieria kofaktorów , podzbiór inżynierii metabolicznej , jest definiowana jako manipulacja wykorzystaniem kofaktorów w szlakach metabolicznych organizmu . W inżynierii kofaktorów stężenia kofaktorów są zmieniane w celu maksymalizacji lub minimalizacji przepływów metabolicznych. Ten rodzaj inżynierii może być wykorzystany do optymalizacji wytwarzania produktu metabolitów lub do zwiększenia wydajności sieci metabolicznej . Wzrasta wykorzystanie inżynierii organizmów jednokomórkowych do tworzenia lukratywnych chemikaliów z tanich surowców, a inżynieria kofaktorów może odegrać kluczową rolę w maksymalizacji produkcji. Dziedzina ta zyskała większą popularność w ciągu ostatniej dekady i ma kilka praktycznych zastosowań w produkcji chemicznej, bioinżynierii i przemyśle farmaceutycznym.

Kofaktory są związkami niebiałkowymi , które wiążą się z białkami i są wymagane do prawidłowego działania katalitycznego białek . Kofaktory można uznać za „cząsteczki pomocnicze” w aktywności biologicznej i często wpływają na funkcjonalność enzymów. Kofaktory mogą być zarówno związkami organicznymi, jak i nieorganicznymi. Niektóre przykłady kofaktorów nieorganicznych to żelazo lub magnez, a niektóre przykłady kofaktorów organicznych obejmują ATP lub koenzym A . Kofaktory organiczne są bardziej szczegółowo znane jako koenzymy , a wiele enzymów wymaga dodania koenzymów, aby przejąć normalną funkcję katalityczną w reakcji metabolicznej. Koenzymy wiążą się z miejscem aktywnym enzymu, aby promować katalizę. Poprzez inżynierię kofaktorów i koenzymów można manipulować naturalnie występującą reakcją metaboliczną, aby zoptymalizować wydajność sieci metabolicznej.

Tło

Kofaktory zostały odkryte przez Arthura Hardena i Williama Younga w 1906 roku, kiedy odkryli, że szybkość fermentacji alkoholowej w ekstraktach z niegotowanych drożdży wzrosła po dodaniu ekstraktu z gotowanych drożdży. Kilka lat później Hans von Euler-Chelpin zidentyfikował kofaktor w gotowanym ekstrakcie jako NAD ⁺ . Inne kofaktory, takie jak ATP i koenzym A, odkryto później w XX wieku. Mechanizm działania kofaktora został odkryty, gdy Otto Heinrich Warburg w 1936 r. ustalił, że NAD ⁺ działa jako akceptor elektronów . Długo po tych początkowych odkryciach naukowcy zaczęli zdawać sobie sprawę, że manipulacja stężeniami kofaktorów może być wykorzystywana jako narzędzia do poprawy szlaków metabolicznych .

Ważną grupą kofaktorów organicznych jest rodzina cząsteczek określanych mianem witamin . Na przykład witamina B12 (kobalamina) odgrywa kluczową rolę w ludzkim organizmie, podczas gdy koenzym B12 , jej pochodna, znajduje się w metabolizmie każdego rodzaju komórki w naszym ciele. Jego obecność wpływa na syntezę i regulację DNA komórkowego oraz bierze udział w syntezie kwasów tłuszczowych i produkcji energii. Kofaktory są wymagane przez wiele ważnych szlaków metabolicznych i możliwe jest, że stężenia jednego rodzaju kofaktorów wpływają na przepływy wielu różnych szlaków.

Minerały i jony metali, które organizmy pobierają wraz z dietą, stanowią doskonałe przykłady kofaktorów nieorganicznych . Na przykład Zn ²⁺ jest potrzebny do wspomagania enzymu anhydrazy węglanowej, ponieważ przekształca on dwutlenek węgla i wodę w wodorowęglan i protony. Powszechnie uznanym minerałem pełniącym rolę kofaktora jest żelazo, które jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania hemoglobiny , białka transportującego tlen znajdującego się w czerwonych krwinkach . Ten przykład w szczególności podkreśla znaczenie kofaktorów w metabolizmie zwierząt .

Znaczenie

Inżynieria kofaktorów jest istotna w manipulacji szlakami metabolicznymi . Szlak metaboliczny to szereg reakcji chemicznych zachodzących w organizmie. Inżynieria metaboliczna jest przedmiotem zmiany przepływów w szlaku metabolicznym. W inżynierii metabolicznej szlak metaboliczny można bezpośrednio zmienić poprzez zmianę funkcjonalności enzymów biorących udział w szlaku. Inżynieria kofaktorów oferuje odmienne podejście i pewne korzyści do zmiany szlaku metabolicznego. Zamiast zmieniać enzymy wykorzystywane w szlaku, można zmienić kofaktory. Może to dać inżynierom metabolizmu przewagę dzięki pewnym właściwościom kofaktorów i możliwości ich modyfikacji.

Ścieżki metaboliczne mogą być wykorzystane przez inżynierów metabolicznych do stworzenia pożądanego produktu. Modyfikując rodzaje stosowanych kofaktorów i czasy, w których są używane, może zmienić się wynik sieci metabolicznej. Aby stworzyć większą produkcję produktu, inżynierowie metabolizmu mają możliwość zaopatrywania sieci w taki kofaktor, który najlepiej pasuje do tego konkretnego procesu. Prowadzi to do optymalizacji sieci, aby uzyskać wyższą produkcję pożądanych produktów. Również zmiana kofaktorów wykorzystywanych w sieci może być pomysłowym rozwiązaniem skomplikowanego problemu. Sieć obecna w komórce, ale często nieużywana, może mieć pożądany produkt. Zamiast opracowywać zupełnie nowy zestaw ścieżek wytwarzania produktu, można zastosować inżynierię kofaktorów. Przez zastąpienie enzymów w celu wykorzystania kofaktorów łatwo dostępnych w komórce, typowo nieużywana sieć nie jest już ograniczana przez kofaktory, a produkcja może zostać zwiększona.

Oprócz modyfikacji wydajności sieci metabolicznych, zmiana kofaktorów stosowanych w sieci może obniżyć koszty operacyjne podczas próby wytworzenia pożądanego produktu. NADH i NADPH to dwa niezwykle powszechne kofaktory komórkowe, różniące się jedynie obecnością grupy fosforanowej. Jednak ta grupa fosforanowa sprawia, że ​​NADPH jest znacznie mniej stabilny niż NADH, a zatem droższy w syntezie. Dlatego korzystne jest wypróbowanie i użycie NADH w niektórych sieciach komórkowych, ponieważ jest on często tańszy, łatwiej dostępny i spełnia to samo zadanie co NADPH.

Narzędzia i procesy

Inżynieria kofaktorów najczęściej zajmuje się manipulacją mikroorganizmami, takimi jak Saccharomyces cerevisiae i Escherichia coli , i jako taka wymaga zastosowania technik rekombinacji DNA . Techniki te wykorzystują małe okrągłe odcinki DNA zwane plazmidami , które mogą być wprowadzane i włączane przez mikroorganizmy , takie jak Escherichia coli . Plazmidy te są specjalnie zaprojektowane w laboratoriach, aby można je było łatwo włączać i wpływać na ekspresję różnych białek , metabolitów i enzymów . Na przykład określony plazmid może spowodować zmianę w sekwencji aminokwasowej enzymu , co może zwiększyć jego powinowactwo do określonego substratu .

Mikroorganizmy do wzrostu wymagają podłoża, a powszechnie stosowanym do hodowli Escherichia coli jest bulion Luria-Bertani (LB). Ta pożywka jest często uzupełniana glukozą i często zawiera dodatkowe cząsteczki zaprojektowane w celu ułatwienia optymalnego wzrostu hodowli. Prekultury można następnie hodować w wytrząsanych kolbach. Są to po prostu zatkane kolby Erlenmeyera, które są pozostawione na wytrząsarce orbitalnej, która obraca się z bardzo dużą prędkością obrotową . Proces ten napowietrza kulturę, co jest niezbędne do optymalnego wzrostu. Gdy prekultury są gotowe, plazmidy potrzebne do konkretnych eksperymentów dodaje się do każdej hodowli oddzielnie, a następnie każdą hodowlę przenosi się do bioreaktora. Bioreaktory to systemy, które pozwalają kulturom rosnąć w kontrolowanym środowisku. To pozostawia wprowadzone plazmidy jako jedyną niezależną zmienną. Wymagana temperatura, pH , stężenia metabolitów i różne inne czynniki środowiskowe mogą być utrzymywane przez bioreaktor, zapewniając identyczne warunki wzrostu dla każdej kultury.

Po pozostawieniu próbek do wzrostu w reaktorze przez określony czas można je usunąć i zbadać w celu ustalenia, czy zamierzone zmiany w organizmie są oczywiste. Ponieważ inżynieria kofaktorów najczęściej zajmuje się szlakami metabolicznymi , organizmy te są często badane, ale wprowadzają określone, oznakowane fluorescencyjne metabolity i dokumentują ich progresję przez różne szlaki. W innych przypadkach wyniki są bardziej oczywiste i łatwe do zaobserwowania, na przykład w przypadku zmniejszonej produkcji etanolu w drożdżach, o której mowa poniżej.

Aplikacje

Zmiana kofaktora enzymu z NADPH na NADH

Biokatalizatory są wymagane do produkcji chiralnych bloków budulcowych potrzebnych w farmaceutykach i innych chemikaliach używanych przez społeczeństwo. Wiele takich biokatalizatorów wymaga NADPH jako kofaktora . NADPH, kofaktor dość podobny do NADH, jest zarówno droższy, jak i mniej stabilny niż jego odpowiednik NADH . Z tych powodów producenci woleliby, aby biokatalizatory, których używają w swoich liniach produkcyjnych, akceptowały NADH zamiast NADPH. Inżynieria kofaktorów odniosła ostatnio sukces w zmianie enzymów, aby preferować NADH jako kofaktor zamiast NADPH. W 2010 roku grupa naukowców przeprowadziła inżynierię kofaktorów enzymu Gre2p, preferującej NADPH dehydrogenazy występującej w Saccharomyces cerevisiae . Gre2p redukuje związek diketonowy 2,5-heksanodion do chiralnych bloków budulcowych (5S)-hydroksy-2-heksanon i (2S,5S)-heksanodiol. Naukowcy ustalili, że Asn9 ( Asparagina , pozycja 9) jest ważnym aminokwasem, aktywnym miejscem Gre2p. W szczególności Asn9 wiąże się z grupą 3'-hydroksylową i atomem 2'-tlenu ugrupowania adenylorybozy . Poprzez bezpośrednią mutagenezę naukowcy wymienili Asn9 zarówno na Asp ( kwas asparaginowy ), jak i Glu ( kwas glutaminowy ). Ta zmiana spowodowała, że ​​Gre2p miał zmniejszoną zależność od NADPH i zwiększone powinowactwo do NADH. Spowodowało to zwiększoną aktywność Gre2p podczas stosowania NADH. Zaobserwowano, że zastąpienie Asn9 Glu daje większy efekt niż zmiana Asn9 na Asp. Asn zawiera polarny nienaładowany łańcuch boczny, podczas gdy zarówno Asp, jak i Glu zawierają polarny naładowany łańcuch boczny. Zwiększone działanie Glu jest spowodowane dodatkowym węglem w jego łańcuchu bocznym, który zbliża go do ugrupowania adenylorybozy. Pozwala to na silniejsze wiązania wodorowe między grupami hydroksylowymi 2'- i 3'-rybozy a grupą karboksylową łańcucha bocznego . Maksymalna prędkość reakcji podwoiła się przy zastosowaniu NADH, gdy Asn9 zastąpiono Glu. Dzięki tym wynikom naukowcy z powodzeniem zaprojektowali Gre2p, aby preferować NADH nad NADPH i zwiększyć szybkość redukcji 2,5-heksanodionu. Umożliwi to firmom chemicznym zmniejszenie kosztów produkcji poprzez zastosowanie NADH zamiast NADPH, przynajmniej do tej konkretnej redukcji.

Zmiana preferencji dotyczących kofaktorów sieci

Alternatywnym przykładem zmiany preferencji enzymu dla kofaktorów jest zmiana reakcji zależnej od NADH na reakcje zależne od NADPH. W tym przykładzie same enzymy nie są zmieniane, ale zamiast tego wybierane są różne enzymy, które przeprowadzają tę samą reakcję z użyciem innego kofaktora. Stworzono specjalnie zaprojektowany szlak, aby wytworzyć 1-butanol z Acetyl-CoA poprzez zmianę enzymów w szlaku metabolicznym S. elongatus . Clostridium rodzaju znane jest wytwarzanie 1-butanol, dostarczając ścieżkę, która może być włożona w S. elongatus. Szlak ten syntetyzuje 1-butanol przy użyciu odwrotnego szlaku β-oksydacji. Enzymy zaangażowane w ten nowo opracowany szlak były specyficzne dla NADH, co było problematyczne dla replikacji szlaku w S. elongatus, ponieważ cyjanobakterie wytwarzają znacznie więcej NADPH niż NADH.

Następnie grupa badawcza zidentyfikowała enzymy wykorzystujące NADPH lub zarówno NADPH, jak i NADH poprzez bioprospektywę . Stwierdzono, że reduktaza acetoacetylo-CoA (PhaB) jest odpowiednim zamiennikiem dehydrogenazy hydroksymasłowej (Hbd). Aby zastąpić AdhE2, naukowcy odkryli, że dehydrogenaza alkoholowa zależna od NADP (YqhD) z E. coli jest skuteczna w tym szlaku. Ponadto naukowcy potrzebowali dehydrogenazy, aby zastąpić zdolność AdhE2 do dehydrogenazy aldehydowej. Stwierdzono, że odpowiednia jest dehydrogenaza butyraldehydu acylującego CoA (Bldh) z C. saccharoperbutylacetonicum. Razem, PhaB, Bldh, YqhD mogą zastąpić odpowiednio Hbd i AdhE2, aby zmienić preferencję kofaktora redukcji 3-ketobutyrylo-CoA z użycia NADH na użycie NADPH. Następnie autorzy skonstruowali różne kombinacje różnych enzymów (tych znajdujących się w szlaku odwrotnego utleniania i enzymów wykorzystujących NADPH) poprzez nadekspresję różnych genów w hodowlach S. elongatus PCC 7942. W tym celu skonstruowali plazmidy zawierające geny odpowiadające enzymom i połączył je w genom S. elongates. Po testach enzymatycznych szczep cyjanobakterii wyrażający enzymy wykorzystujące NADPH wytwarzał największą ilość 1-butanolu (29,9 mg/L), czterokrotnie przewyższając ilość szczepów, które nie zawierały enzymów wykorzystujących NADPH. Ogólnie rzecz biorąc, 1-butanol został wyprodukowany w S. elongatus przy użyciu szlaku z innego organizmu. Szlak ten został zmodyfikowany w celu dopasowania preferowanego kofaktora redukującego dla cyjanobakterii.

Modyfikowanie strumienia metabolitów za pomocą równowagi kofaktorów

W inżynierii kofaktorów szlak metaboliczny jest zmieniany przez zmianę stężeń określonych kofaktorów wytwarzanych w tym konkretnym szlaku lub w oddzielnym szlaku. Na przykład hipotetyczny organizm może mieć dwie arbitralne ścieżki zwane A i B, w których niektóre enzymy w obu A i B wykorzystują te same kofaktory. Jeśli naukowcy chcieliby zmniejszyć wydajność szlaku A, mogą najpierw rozważyć bezpośrednią inżynierię enzymów zaangażowanych w A, być może w celu zmniejszenia powinowactwa określonego miejsca aktywnego do jego substratu . Jednak w niektórych przypadkach enzymy w A mogą być trudne do zmodyfikowania z różnych powodów lub może być niemożliwe zmodyfikowanie ich bez niebezpiecznego wpływu na trzecią ścieżkę metaboliczną C, która wykorzystuje te same enzymy. Jako osobną opcję naukowcy mogliby zwiększyć strumień B, co może być łatwiejsze do zaprojektowania. To z kolei może „związać” kofaktory potrzebne A, co spowolniłoby aktywność enzymatyczną , zmniejszając produkcję w A. Jest to jeden hipotetyczny przykład wykorzystania inżynierii kofaktorów, ale istnieje wiele innych wyjątkowych przypadków, w których naukowcy używają kofaktorów jako sposób na zmianę szlaków metabolicznych. Główną zaletą inżynierii kofaktorów jest to, że naukowcy mogą wykorzystać ją do skutecznej zmiany szlaków metabolicznych, które są trudne do zmodyfikowania za pomocą zwykłej inżynierii metabolicznej. Osiąga się to poprzez celowanie w łatwiejsze do inżynierii enzymy w oddzielnych ścieżkach, które wykorzystują te same kofaktory. Ponieważ wiele kofaktorów jest wykorzystywanych przez różne enzymy w wielu szlakach, inżynieria kofaktorów może być wydajną, opłacalną alternatywą dla obecnych metod inżynierii metabolicznej.

Drożdże są powszechnie stosowane w przemyśle piwnym i winiarskim, ponieważ są zdolne do wydajnej produkcji etanolu poprzez fermentację szlaku metabolicznego przy braku tlenu. Fermentacja wymaga enzymu dehydrogenazy gliceryno-3-fosforanowej (GPDH), który zależy od kofaktora NADH . Szlak ten obejmuje konwersję glukozy zarówno do etanolu, jak i glicerolu , które wykorzystują NADH jako kofaktor . Naukowcy zmodyfikowali Saccharomyces cerevisiae, aby nadprodukować GPDH, co przesunęło metabolizm komórek z etanolu w kierunku glicerolu, ograniczając dostępność NADH w części szlaku produkującej etanol. Odwrotny efekt osiągnięto poprzez wpływanie na oddzielny szlak w komórce, szlak syntezy glutaminianu . Inaktywacja ekspresji enzymu dehydrogenazy glutaminianu , która jest zależna od NADPH , oraz nadekspresja enzymów syntetazy glutaminianu i syntetazy glutaminianu , które opierają się na NADH jako kofaktorze, zmieniły równowagę kofaktorów w szlaku syntezy glutaminianu. Szlak jest teraz zależny od NADH, a nie NADPH, co zmniejsza dostępność NADH w szlaku fermentacyjnym. To z kolei powoduje zwiększoną produkcję etanolu i zmniejszoną produkcję glicerolu . Ta metoda manipulowania strumieniami metabolicznymi mogłaby być wizualizowana podobnie jak światowe rynki paliw, gdzie zwiększona produkcja etanolu do użytku w przemyśle motoryzacyjnym zmniejszyłaby jego dostępność w przemyśle spożywczym. Zasadniczo produkcja większej liczby silników napędzanych etanolem może spowodować zmniejszenie zużycia przetworzonych słodyczy, które zawierają syrop kukurydziany o wysokiej zawartości fruktozy . Ta inżynieria kofaktorów ma zastosowanie w przemyśle piwnym i winiarskim, ponieważ pozwala na regulację poziomu etanolu w napojach alkoholowych. Postępy w przemyśle winiarskim spowodowały stały wzrost zawartości etanolu, więc w szczególności winiarze byliby zainteresowani możliwością obniżenia poziomu etanolu w niektórych ich winach.

Cykl kwasu cytrynowego

Koenzym A (CoA) i acetylo-CoA to dwa pośrednie metabolity , występujące przede wszystkim w cyklu kwasu cytrynowego , które uczestniczą w ponad 100 różnych reakcjach metabolizmu mikroorganizmów. Ostatnie eksperymenty wykazały, że nadekspresja enzymu kinazy pantotenianowej i suplementacja kwasu pantotenowego w szlaku biosyntezy CoA umożliwiły dostosowanie przepływów zarówno CoA, jak i acetylo-CoA. To zwiększone stężenie kofaktorów spowodowało zwiększony przepływ węgla w szlaku syntezy octanu izoamylu , zwiększenie wydajności produkcji octanu izoamylu. Octan izoamylu jest używany przemysłowo do sztucznego aromatyzowania oraz do testowania skuteczności respiratorów . Oprócz produkcji octanu izoamylu manipulacja biosyntezą CoA podczas reakcji hydrogenazy pirogronianowej powoduje również wzrost produkcji zarówno bursztynianu, jak i likopenu , z których każdy ma korzystny wpływ na organizm człowieka. Wzrost stężenia bursztynianu, który jest stosowany jako katalizator , może prowadzić do zwiększenia szybkości cyklu kwasu cytrynowego, a co za tym idzie metabolizmu osobnika . Wykazano, że zwiększenie stężenia likopenu zmniejsza ryzyko raka prostaty . Potencjalne korzyści płynące z powtórzenia takiego wyczynu inżynierii kofaktorów i pomyślnego włączenia ich do praktyk branżowych są niezliczone.

Produkcja papieru

Wiele ważnych enzymów przemysłowych wykorzystuje kofaktory do katalizowania reakcji. Używając kofaktorów do manipulowania szlakami metabolicznymi , można obniżyć koszty materiałów, wyeliminować etapy produkcji, skrócić czas produkcji, zmniejszyć zanieczyszczenie i zwiększyć ogólną wydajność produkcji. Jeden przypadek, który pokazuje kilka z tych korzyści produkcyjnych, dotyczy inżynierii genetycznej drzew osiki . W procesie produkcji papieru zakłady produkcyjne muszą rozkładać ligninę , związek biochemiczny, który nadaje pniu drzewa sztywność, w celu wytworzenia masy celulozowej wykorzystywanej przez resztę produkcji. Proces roztwarzania chemicznego wymaga od zakładu produkcyjnego zużycia znacznej ilości energii, a także wielu drogich i toksycznych chemikaliów. Grupa inżynierów genetycznych, poprzez inżynierię kofaktorów , stworzyła genetycznie lepsze drzewo osiki, które wytwarzało mniej ligniny. Te genetycznie zmodyfikowane drzewa pozwoliły papierniom na zmniejszenie kosztów, zanieczyszczenia i czasu produkcji.

Inne przykłady

Organizm	Co się zmieniło	Co to znaczy
Mycobacterium smegmatis	Koenzym F420	Może wyłączyć kofaktor, który prowadzi do gruźlicy lekoopornej
Cyjanobakteria	Kofaktor żelazowo-molibdenowy	Produkcja wodoru gazowego dla energii
Królestwo Archea	Molibden nitrogenazy Pierwiastek	Poprawa efektywności wiązania azotu
Thermoanaerobacteria mathranii	dehydrogenaza glicerolowa	Spraw, aby bakterie termofilne produkowały etanol bardziej wydajnie

Krótki opis innych znaczących przykładów zastosowania inżynierii kofaktorów.

Uwagi