inteina - Intein
Inteiny jest segment białka zdolnego do wycięcia się i przyłączyć pozostałe części (na ekstein ) z wiązaniem peptydowym w proces określany jako białka składania . Intein zostały również nazywane „białko introny ”.
Inteiny składanie białka występuje po zawierający inteina mRNA jest tłumaczone na białko. Białko prekursora zawiera trzy segmenty o- N-extein następnie inteiny następnie C extein . Po forniru miało miejsce, powstające białko zawiera N-extein połączony z C-extein; Produkt ten jest również określany forniru o extein.
Zawartość
Historia
Pierwszy inteina został odkryty w 1988 roku przez porównanie sekwencji pomiędzy Neurospora crassa marchew i wakuoli ATPazy (bez intein) i homologicznego genu w drożdżach (z inteiny), który został po raz pierwszy opisany jako przypuszczalny transporter jonów wapnia . W 1990 Hirata et al. wykazano, że dodatkowa sekwencja genu drożdżowego został transkrybowany do mRNA i usuwa się z białka gospodarza dopiero po translacji. Od tamtej pory inteiny zostały znalezione we wszystkich trzech domenach życia (eukariontów, bakterii i archeowców) i wirusy .
Wiele genów mają niepowiązanych inteina kodowania segmentów wstawione w różnych pozycjach. Z tych i innych powodów, inteiny (lub dokładniej, segmenty genowe kodujące intein) są czasami nazywane samolubne elementy genetyczne , ale może to być bardziej dokładne, aby połączyć je pasożytnicze . Według Dawkinsa genów skoncentrowane widzenia 'ewolucji większość geny są «egoistyczne» tylko w jakim celu konkurowania z innymi genami lub alleli ale zazwyczaj spełniają funkcję dla organizmów, natomiast «pasożytniczych elementów genetycznych», przynajmniej na początku, nie rób pozytywny wkład do sprawności organizmu.
W bazie danych wszystkich znanych intein ( Inbase ) 113 znane inteiny są obecne w komórkach eukariotycznych przy minimalnej długości 138 aminokwasów i maksymalnej długości 844 aminokwasów. Pierwszy inteina stwierdzono kodowana w genie VMA z Saccharomyces cerevisiae . Zostały one później stwierdzono w grzybach (Ascomycetes, Basidiomycetes, Zygomycetes i chytrids) i różnych białek, jak również. Białko spokrewnione ze znanymi intein zawierających białko, ale ściśle związane z wielokomórkowych hedgehog białek została opisana mieć sekwencję inteiny z glomeromycota. Wiele z nowo opisanych intein zawierać endonukleaz zasiedlania, a niektóre z nich są widocznie aktywny. Obfitość intein w grzybach wskazuje poziomy transfer genów zawierających inteiny,. Podczas gdy w eubakterie i archeowców, istnieje 289 i 182 obecnie znane inteiny. Nie jest zaskoczeniem, najbardziej inteina w eubakterie i archeonów okaże się, że dodaje się białka metabolicznego kwasu nukleinowego, takie jak grzyby.
Mechanizm
Mechanizm efektu sklejania jest naturalnie występującym analogicznie do techniką chemicznego wytwarzania średnich białek zwanych natywnej ligacji chemicznej , który został opracowany w tym samym czasie, co inteiny zostały odkryte.
Proces rozpoczyna się od przesunięcia NO lub NS gdy łańcuch boczny pierwszego pozostałość ( seryny , treoniny , lub cysteiny ) części inteiny białka prekursorowego nukleofilowo atakuje wiązanie peptydowe pozostałości bezpośrednio przed (czyli ostateczne resztę N-extein) tworząc liniowy ester (lub tioester ), pośredni. Transestryfikacja następuje, gdy łańcuch boczny pierwszej reszty ataków C extein nowo utworzone estru kwasu (tio) do wolnego końca N koniec inteiny. Stanowi rozgałęzioną pośrednim, w którym N-extein i C-extein są przyłączone, jednakże nie za pośrednictwem wiązania peptydowego. Ostatnią resztę inteiny jest zawsze asparaginowy i amidu atom azotu w tym łańcuchu bocznym odstępie rozszczepia wiązanie peptydowe pomiędzy inteiny i C-extein, powstających w wolnej segmentu inteiny z terminalem cyklicznego imidu . Na koniec, wolna grupa aminowa reszty C-extein atakuje teraz (tio) estru łączącą N- i C-ekstein razem. Przesunięcie ON lub SN tworzy wiązanie peptydowe i funkcjonalne, ligacji białka.
w biotechnologii
Intein są bardzo wydajne przy składaniu białka, a oni odpowiednio znaleźć ważną rolę w dziedzinie biotechnologii . Istnieje ponad 200 inteiny zidentyfikowane do tej pory; rozmiary wahają się od 100-800 stowarzyszeniu . Inteiny zostały zaprojektowane do szczególnych zastosowań, takich jak półsyntezy białka i selektywnego znakowania segmentami białkowymi, które jest użyteczne do NMR badań dużych białek.
Hamowanie farmaceutyczny z intein wycięcie może być użytecznym narzędziem do opracowywania leków ; białko, które zawiera inteiny nie przeprowadzi swoją normalną funkcję, jeśli inteina nie akcyzy, ponieważ jego struktura zostanie zakłócone.
Sugerowano, że inteiny może okazać się przydatne do osiągnięcia allotopic ekspresję pewnych wysoce hydrofobowych białek kodowanych przez normalnie mitochondrialnego genomu, na przykład w terapii genowej . Hydrofobowość tych białek jest przeszkodą do ich importowania do mitochondrium. W związku z tym włożenie hydrofobowej inteiny może umożliwić import do tego postępować. Wycięcie inteiny po imporcie będzie następnie przywrócenia białka do typu dzikiego .
Znaczniki powinowactwa są szeroko stosowane do oczyszczania białek rekombinowanych, ponieważ umożliwiają akumulację rekombinowanego białka z drobnych zanieczyszczeń. Jednakże, znacznik powinowactwa powinny być usunięte przez proteazy w końcowym etapie oczyszczania. Dodatkowy etap proteolizy zwiększa problemy specyficzności proteazy usuwania znaczników powinowactwa z białkiem rekombinowanym oraz usuwanie produktu fermentacji. Problem ten można uniknąć przez fuzję znacznik powinowactwa do samoodcinający intein w kontrolowanym otoczeniu. Pierwsza generacja wektorów ekspresyjnych tego rodzaju stosowanych zmodyfikowany Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA) inteiny. Chong i in. stosuje się domeny wiązania chityny (CBD) z Bacillus circulans jako znacznik powinowactwa i znacznik ten połączony ze zmodyfikowanym Sce VMA inteiny. Zmodyfikowany inteina ulega samoodszczepialny reakcji na swoim N-końcu peptydu łącznika z 1,4-ditiotreitolu (DTT), β-merkaptoetanolu (β-Me) lub cystyny w niskich temperaturach, w szerokim zakresie pH. Po ekspresji białka rekombinowanego, homogenat komórek przechodzi przez kolumnę zawierającą chityny . Pozwala to CBD białka chimerycznego wiążą się z kolumną. Ponadto, gdy temperatura jest obniżana i cząsteczek, opisanych powyżej przejściu przez kolumnę, białko chimeryczne ulega samo splicing i tylko docelowe białko wyeluowano. Ta nowa technika eliminuje konieczność stosowania etapu proteolizy, a zmodyfikowany Sce VMA pozostaje w kolumnie załączonej do chityny przez CBD.
Ostatnio inteiny były stosowane do oczyszczania białek, na podstawie własnych agregacji peptydów. Polipeptydy, jak elastyna (ELP) są użyteczne narzędzie w dziedzinie biotechnologii. Fuzji z białkiem docelowym, mają skłonność do tworzenia agregatów wewnątrz komórek. Eliminuje to etap chromatografii potrzebnych do oczyszczania białek. Znaczniki ELP zostały wykorzystane białka fuzyjne inteiny, tak że agregaty mogą być odizolowane bez chromatografii (przez odwirowanie), a następnie znacznik inteiny i może być cięty w sposób kontrolowany w celu uwolnienia docelowego białka w roztworze. Taka izolacja białek może odbywać się za pomocą ciągłego przepływu medium, uzyskując duże ilości białka, co czyni ten sposób bardziej efektywne pod względem ekonomicznym w porównaniu z konwencjonalnymi metodami. Inna grupa badaczy stosować mniejsze znaczniki siebie agregację wyizolować białka docelowego. Małe peptydy amfipatyczne 18A i ELK16 (rysunek 5), użyto do wytworzenia siebie odszczepiających koncentrację białka.
Konwencje nazewnictwa
Pierwsza część inteiny nazwy jest na podstawie nazwy naukowej od organizmu , w którym się znajduje, a druga część jest na podstawie nazwy odpowiedniego genu lub extein. Na przykład, inteiny znaleźć w Thermoplasma acidophilum i związane z wakuoli ATPazy podjednostki A (VMA) zwany jest „Tac VMA”.
Normalnie, jak w tym przykładzie, tylko trzy litery wystarczy, aby określić organizm, ale istnieją różnice. Na przykład, dodatkowe litery mogą być dodawane do wskazania napięcia. Jeśli więcej niż jeden inteiny jest zakodowane w odpowiednim genie inteiny podano przyrostek numeryczny zaczynając od końca 5 'do 3' , lub w celu ich identyfikacji (na przykład „Msm dnaB-1”).
Segment genu, który koduje inteiny jest zwykle takie same nazwy jak inteiny, ale aby uniknąć niejasności nazwa inteiny właściwa wynosi zazwyczaj wielką literą ( np PFU RIR1-1), przy czym nazwa jest segment genu odpowiadającego kursywą ( na przykład , Pfu rir1-1 ).
Pełne i mini inteiny
Inteiny mogą zawierać gen endonukleazy zasiedlającej (HEG) domeny w dodatku do domen do wykonywania połączeń. Domena ta jest odpowiedzialna za rozprzestrzenianie się inteiny poprzez cięcie DNA w inteiny wolne allelu na homologicznej chromosomu , wyzwalające DNA dwuniciowy naprawy przerwa systemu (DSBR), który następnie naprawia przerwania, co kopiowania DNA inteina kodowania w uprzednio inteina-wolnym miejscu. Domena HEG nie jest konieczne składanie intein, a więc może zostać utracone, tworząc minimalną lub mini , inteina . Liczne badania wykazały modułowa intein przez dodanie lub usunięcie domeny HEG i określenia aktywności nowych konstrukcji.
Podział inteiny
Czasami inteiny prekursorowego białka pochodzi z dwóch genów. W tym przypadku, inteina mówi się być podzielone inteina . Na przykład, cyjanobakterii , DnaE The α katalityczna podjednostka polimerazy DNA III , są kodowane przez dwa odrębne geny, dnaE-N i dnaE-C . DnaE N produkt składa się z sekwencji N-extein następuje sekwencja inteiny 123-AA, natomiast dnaE-C produkt składa się z sekwencji inteiny 36 AA następuje sekwencja C-extein.
Zobacz też
Referencje
- Gogarten, J Peter; Elena Hilario (2006). „Intein, introny, i endonukleazy zasiedlania: ostatnie Revelations o cyklu pasożytniczych elementów genetycznych” . BMC Evol Biol . 6 (1): 94. doi : 10.1186 / 1471-2148-6-94 . ISSN 1471-2148 . PMC 1654191 . PMID 17101053 .