Składanie białek - Protein splicing

mechanizm składania białek z udziałem intein
Mechanizm splicingu białek z udziałem intein. Na tym schemacie N-extein jest pokazany na czerwono, intein na czarno, a C-extein na niebiesko. X oznacza atom tlenu lub siarki.

Splicing białka to wewnątrzcząsteczkowa reakcja konkretnego białka, w której wewnętrzny segment białka (zwany inteinem ) jest usuwany z białka prekursorowego poprzez ligację zewnętrznych białek C-końcowych i N-końcowych (zwanych exteinami ) po obu stronach. Złącze splicingowe białka prekursorowego składa się głównie z cysteiny lub seryny , które są aminokwasami zawierającymi nukleofilowy łańcuch boczny . Znane obecnie reakcje składania białek nie wymagają egzogennych kofaktorów ani źródeł energii, takich jak trifosforan adenozyny (ATP) lub trifosforan guanozyny (GTP). Zwykle splicing jest związany tylko ze splicingiem pre-mRNA . To białko prekursorowe zawiera trzy segmenty — N-extein, po którym następuje inteina, a następnie C-extein . Po wykonaniu splicingu powstałe białko zawiera N-exteinę połączoną z C-extein; ten produkt do splicingu jest również określany jako extein.

Historia

Pierwszy inteina został odkryty w 1988 roku przez porównanie sekwencji pomiędzy Neurospora crassa i marchewki wakuoli ATPazy (bez intein) i homologicznego genu w drożdżach (z intein), który został po raz pierwszy opisany jako przypuszczalny transporter jonów wapnia . W 1990 Hirata i in. wykazali, że dodatkowa sekwencja w genie drożdży uległa transkrypcji do mRNA i usunęła się z białka gospodarza dopiero po translacji. Od tego czasu inteiny zostały znalezione we wszystkich trzech domenach życia (eukarionty, bakterie i archeony) oraz w wirusach .

Składanie białka było niespodziewane i jej mechanizmów zostały odkryte przez dwie grupy (Anraku i Stevens) w roku 1990. Obie odkrył Saccharomyces cerevisiae VMA1 w prekursora wakuoli H + - ATPazy enzymu. Sekwencja aminokwasów N- i C-końców odpowiadała 70% sekwencji DNA wakuolowej H + -ATPazy z innych organizmów, podczas gdy sekwencja aminokwasów pozycji centralnej odpowiadała 30% całkowitej sekwencji DNA drożdże HO nukleazy .

Wiele genów ma niespokrewnione segmenty kodujące inteinę wstawione w różnych pozycjach. Z tych i innych powodów inteiny (a właściwie segmenty genów kodujące inteiny) są czasami nazywane samolubnymi elementami genetycznymi , ale może być bardziej trafne nazywanie ich pasożytniczymi . Zgodnie z poglądem na ewolucję skoncentrowanym na genach, większość genów jest „samolubna” tylko o tyle, że konkuruje z innymi genami lub allelami, ale zazwyczaj pełnią one funkcję dla organizmów, podczas gdy „pasożytnicze elementy genetyczne”, przynajmniej na początku, nie tworzą żadnej pozytywny wkład w sprawność organizmu.

W bazie danych wszystkich znanych intein [1] , 113 znanych intein występuje u eukariontów o minimalnej długości 138 aminokwasów i maksymalnej długości 844 aminokwasów. Znaleziono pierwszą inteinę zakodowaną w genie VMA Saccharomyces cerevisiae . Odkryto je później w grzybach (ascomycetes, basidiomycetes, sprzygomycetes i chytrids), a także w różnych białkach. Opisano, że białko daleko spokrewnione ze znanymi białkami zawierającymi inteiny, ale blisko spokrewnione z białkami hegehog metazoan , ma sekwencję inteiny z Glomeromycota. Wiele nowo opisanych intein zawiera endonukleazy zasiedlające, a niektóre z nich są najwyraźniej aktywne. Obfitość inteiny w grzybach wskazuje na boczny transfer genów zawierających inteinę. W przypadku eubakterii i archeonów, obecnie znanych jest 289 i 182 intein. Nic dziwnego, że większość inteiny u eubakterii i archeonów jest wstawiona do białka metabolicznego kwasu nukleinowego, podobnie jak grzyby.

Mechanizm

Proces rozpoczyna się przesunięciem NO lub NS, gdy łańcuch boczny pierwszej reszty ( seryny , treoniny lub cysteiny ) części inteinowej białka prekursorowego atakuje nukleofilowo wiązanie peptydowe reszty bezpośrednio przed reszty N-exteiny) z wytworzeniem liniowego estru (lub tioestru ) pośredniego. Transestryfikacja następuje, gdy łańcuch boczny pierwszej reszty ataków C-extein nowo utworzone estru kwasu (tio) do wolnego końca N koniec inteiny. Tworzy to rozgałęziony produkt pośredni, w którym przyłączone są N-extein i C-extein, aczkolwiek nie przez wiązanie peptydowe. Ostatnią resztą inteiny jest zawsze asparagina , a amidowy atom azotu tego łańcucha bocznego rozszczepia wiązanie peptydowe między inteiną a C-exteiną, dając wolny segment inteiny z terminalnym cyklicznym imidem . Wreszcie, wolna grupa aminowa C-extein atakuje teraz (tio)ester łączący ze sobą N- i C-exteiny. Przesunięcie ON lub SN wytwarza wiązanie peptydowe i funkcjonalne, zligowane białko.

Mechanizm efektu splicingu jest naturalnie występującą analogią do techniki chemicznego wytwarzania średniej wielkości białek zwanej natywną ligacją chemiczną .

Intein

Inteiny jest segment białka zdolnego do wycięcia się i przyłączyć pozostałe części (na ekstein ) o wiązanie peptydowe podczas składania białka. Inteiny są również nazywane intronami białkowymi , przez analogię z intronami (RNA) .

Konwencje nazewnictwa

Pierwsza część inteiny nazwy jest na podstawie nazwy naukowej od organizmu , w którym się znajduje, a druga część jest na podstawie nazwy odpowiedniego genu lub extein. Na przykład inteina znaleziona w Thermoplasma acidophilum i powiązana z podjednostką ATPazy Vacuolar (VMA) nazywa się „Tac VMA”.

Normalnie, tak jak w tym przykładzie, do określenia organizmu wystarczą tylko trzy litery, ale istnieją różnice. Na przykład można dodać dodatkowe litery, aby wskazać szczep. Jeśli więcej niż jedna inteina jest zakodowana w odpowiednim genie, inteinom nadaje się przyrostek numeryczny rozpoczynający się od 5' do 3' lub w kolejności ich identyfikacji (na przykład "Msm dnaB-1").

Segmentowi genu kodującego inteinę zwykle nadaje się taką samą nazwę jak inteina, ale aby uniknąć nieporozumień, nazwa właściwej inteiny jest zwykle pisana wielkimi literami ( np. Pfu RIR1-1), podczas gdy nazwa odpowiedniego segmentu genu to kursywa ( np. Pfu rir1-1 ).

Rodzaje potraw

Rodzaj białek splicingowych dzieli się na cztery klasy: maxi-intein, mini-intein, trans-splicing intein i alanina intein. Maxi-inteiny to N- i C-końcowe domeny splicingowe zawierające domenę endonukleazy. Mini-inteiny są typowymi domenami N- i C-końcowego splicingu; jednak domena endonukleazy nie jest obecna. W trans-splicing intein, inteina jest podzielona na dwie (lub być może więcej) domeny, które są następnie dzielone na N-końce i C-końce. Inteiny alaninowe mają złącze splicingowe alaniny zamiast cysteiny lub seryny, w których występuje splicing białek.

Pełne i mini inteins

Inteiny mogą zawierać domenę genu endonukleazy zasiedlania (HEG) oprócz domen splicingowych. Ta domena jest odpowiedzialna za rozprzestrzenianie się inteiny poprzez cięcie DNA w wolnym od inteiny allelu na homologicznym chromosomie , uruchamiając system naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (DSBR), który następnie naprawia pęknięcie, kopiując w ten sposób DNA kodujący inteinę do witryny wcześniej wolnej od intein. Domena HEG nie jest konieczne składanie intein, a więc może zostać utracone, tworząc minimalną lub mini , inteina . Kilka badań wykazało modułową naturę intein poprzez dodanie lub usunięcie domen HEG i określenie aktywności nowego konstruktu.

Podziel się jedzeniem

Czasami inteina białka prekursorowego pochodzi z dwóch genów. W tym przypadku mówi się, że intein jest podzieloną intein . Na przykład, cyjanobakterii , DnaE The α katalityczna podjednostka DNA polimerazy III , są kodowane przez dwa odrębne geny, dnaE-n i dnaE-C . DnaE N produkt składa się z N-extein sekwencji następnie 123-AA inteiny sekwencji, podczas gdy dnaE-C produkt składa się z 36-AA inteiny sekwencji następuje sekwencja C-extein.

Zastosowania w biotechnologii

Inteiny są bardzo wydajne w splicingu białek i dlatego znalazły ważną rolę w biotechnologii . Do tej pory zidentyfikowano ponad 200 inteinów; rozmiary wahają się od 100-800 AA . Inteiny zostały zaprojektowane do konkretnych zastosowań, takich jak półsynteza białek i selektywne znakowanie segmentów białek, co jest przydatne w badaniach NMR dużych białek.

Farmaceutyczne hamowanie wycięcia inteiny może być użytecznym narzędziem do opracowywania leków ; białko zawierające inteinę nie będzie pełnić swojej normalnej funkcji, jeśli inteina nie zostanie wycięta, ponieważ jej struktura zostanie zakłócona.

Zasugerowano, że inteiny mogą okazać się przydatne do uzyskania alotopowej ekspresji pewnych wysoce hydrofobowych białek normalnie kodowanych przez genom mitochondrialny , na przykład w terapii genowej . Hydrofobowość tych białek jest przeszkodą w ich imporcie do mitochondriów. Dlatego wstawienie niehydrofobowej inteiny może umożliwić kontynuację tego importu. Wycięcie inteiny po imporcie przywróciłoby białko typu dzikiego .

Znaczniki powinowactwa są szeroko stosowane do oczyszczania rekombinowanych białek, ponieważ umożliwiają gromadzenie rekombinowanego białka z niewielką ilością zanieczyszczeń. Jednak znacznik powinowactwa musi zostać usunięty przez proteazy w końcowym etapie oczyszczania. Etap dodatkowej proteolizy stwarza problemy związane ze specyficznością proteazy w usuwaniu znaczników powinowactwa z rekombinowanego białka i usuwaniu produktu trawienia. Problemu tego można uniknąć przez połączenie znacznika powinowactwa z samoodcinającymi się inteinami w kontrolowanym środowisku. Pierwsza generacja wektorów ekspresyjnych tego rodzaju wykorzystywała zmodyfikowaną inteinę Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA). Chong i in. zastosował domenę wiążącą chitynę (CBD) z Bacillus circulans jako znacznik powinowactwa i połączył ten znacznik ze zmodyfikowaną inteiną Sce VMA. Zmodyfikowana inteina przechodzi reakcję samorozszczepiania na N-końcowym wiązaniu peptydowym z 1,4-ditiotreitolem (DTT), β-merkaptoetanolem (β-ME) lub cystyną w niskich temperaturach w szerokim zakresie pH. Po ekspresji zrekombinowanego białka, homogenat komórek przepuszcza się przez kolumnę zawierającą chitynę . Pozwala to CBD białka chimerycznego związać się z kolumną. Ponadto, gdy temperatura jest obniżona i opisane powyżej cząsteczki przechodzą przez kolumnę, białko chimeryczne ulega samodzieleniu i eluowane jest tylko białko docelowe. Ta nowatorska technika eliminuje potrzebę etapu proteolizy, a zmodyfikowany Sce VMA pozostaje w kolumnie połączony z chityną poprzez CBD.

Ostatnio inteiny są używane do oczyszczania białek opartych na samoagregujących peptydach. Polipeptydy podobne do elastyny (ELP) są użytecznym narzędziem w biotechnologii. W połączeniu z białkiem docelowym mają tendencję do tworzenia agregatów wewnątrz komórek. Eliminuje to etap chromatograficzny potrzebny do oczyszczania białek. Znaczniki ELP zastosowano w białku fuzyjnym inteiny, tak że agregaty można izolować bez chromatografii (przez wirowanie), a następnie inteinę i znacznik można rozszczepić w sposób kontrolowany w celu uwolnienia białka docelowego do roztworu. Ta izolacja białka może być przeprowadzona przy użyciu ciągłego przepływu mediów, dając duże ilości białka, co czyni ten proces bardziej ekonomicznym niż konwencjonalne metody. Inna grupa badaczy użyła mniejszych samoagregujących znaczników do wyizolowania białka docelowego. Małe amfipatyczne peptydy 18A i ELK16 (figura 5) zastosowano do utworzenia samorozszczepiającego się agregującego białka.

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura

Zewnętrzne linki