Synteza oligonukleotydów - Oligonucleotide synthesis

Synteza oligonukleotydów to synteza chemiczna stosunkowo krótkich fragmentów kwasów nukleinowych o określonej strukturze chemicznej ( sekwencji ). Technika ta jest niezwykle przydatna w obecnej praktyce laboratoryjnej, ponieważ zapewnia szybki i niedrogi dostęp do wykonanych na zamówienie oligonukleotydów o pożądanej sekwencji. Podczas gdy enzymy syntetyzują DNA i RNA tylko w kierunku 5' do 3' , chemiczna synteza oligonukleotydów nie ma tego ograniczenia, chociaż najczęściej jest przeprowadzana w kierunku przeciwnym, 3' do 5'. Obecnie proces realizowany jest jako synteza w fazie stałej metodą amidofosforynową i amidofosforynowymi cegiełkami pochodzącymi z zabezpieczonych 2'-deoksynukleozydów ( dA , dC , dG i T ), rybonukleozydów ( A , C , G i U ) lub chemicznie modyfikowane nukleozydy, np. LNA lub BNA .

Aby uzyskać pożądany oligonukleotyd, bloki budulcowe są sekwencyjnie sprzęgane z rosnącym łańcuchem oligonukleotydowym w kolejności wymaganej przez sekwencję produktu (patrz Cykl syntetyczny poniżej). Proces jest w pełni zautomatyzowany od końca lat 70-tych. Po zakończeniu montażu łańcucha produkt jest uwalniany z fazy stałej do roztworu, odbezpieczany i zbierany. Występowanie reakcji ubocznych wyznacza praktyczne granice długości syntetycznych oligonukleotydów (do około 200 reszt nukleotydowych ), ponieważ liczba błędów kumuluje się wraz z długością syntetyzowanego oligonukleotydu. Produkty są często izolowane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w celu uzyskania pożądanych oligonukleotydów o wysokiej czystości. Zazwyczaj syntetyczne oligonukleotydy są jednoniciowymi cząsteczkami DNA lub RNA o długości około 15-25 zasad.

Oligonukleotydy znajdują różnorodne zastosowania w biologii molekularnej i medycynie. Najczęściej stosuje się je jako antysensowne oligonukleotydy, małe interferujące RNA , startery do sekwencjonowania i amplifikacji DNA , sondy do wykrywania komplementarnego DNA lub RNA poprzez hybrydyzację molekularną , narzędzia do celowego wprowadzania mutacji i miejsc restrykcyjnych oraz do syntezy sztucznych genów .

Historia

Ewolucja syntezy oligonukleotydów obejmowała cztery główne metody tworzenia wiązań międzynukleozydowych i została szczegółowo opisana w literaturze.

Wczesne prace i współczesna synteza H-fosfonianów

Schemat. 1. I : N -chlorosukcynimid; Bn = -CH 2 Ph

We wczesnych latach pięćdziesiątych grupa Alexandra Todda była pionierem w metodach syntezy oligonukleotydów z H-fosfonianem i fosforanem . Reakcja związków 1 i 2 z wytworzeniem diestru H-fosfonianu 3 jest sprzęganiem H-fosfonianu w roztworze, podczas gdy reakcja związków 4 i 5 z wytworzeniem 6 jest sprzęganiem fosfotriestru (patrz synteza fosfotriestru poniżej).

Schemat 2. Synteza oligonukleotydów metodą H-fosfonianu

Trzydzieści lat później ta praca zainspirowała niezależnie dwie grupy badawcze do zaadoptowania chemii H-fosfonianów do syntezy w fazie stałej przy użyciu monoestrów nukleozydów H-fosfonianowych 7 jako elementów budulcowych oraz chlorku piwaloilu, chlorku 2,4,6-triizopropylobenzenosulfonylu (TPS). -Cl) oraz inne związki jako aktywatory. Praktyczne wdrożenie metody H-fosfonianów zaowocowało bardzo krótkim i prostym cyklem syntezy składającym się tylko z dwóch etapów, detritylacji i sprzęgania (Schemat 2). Utlenianie międzynukleozydowych wiązań H-fosfonianowych diestrów w 8 z wiązaniami fosfodiestrowymi w 9 za pomocą roztworu jodu w wodnej pirydynie prowadzi się raczej na końcu układu łańcuchów niż jako etap w cyklu syntezy. W razie potrzeby utlenianie można prowadzić w warunkach bezwodnych. Alternatywnie, 8 można przekształcić do fosforotionianu 10 lub phosphoroselenoate 11 (X = Se), albo utlenia się CCI 4 w obecności amin pierwszorzędowych lub drugorzędowych analogów fosforamidatowych 12 . Metoda jest bardzo dogodna, ponieważ do tego samego oligonukleotydu można wprowadzić różne rodzaje modyfikacji fosforanowych (fosforan/fosforotionian/fosforamid) w celu modulowania jego właściwości.

Najczęściej bloki budulcowe H-fosfonianu są chronione przy grupie 5'-hydroksylowej i grupie aminowej zasad nukleinowych A, C i G w taki sam sposób jak bloki budulcowe amidofosforynowe (patrz poniżej). Jednak ochrona na grupie aminowej nie jest obowiązkowa.

Synteza fosfodiestrów

Schemat. 3 Sprzęganie oligonukleotydów metodą fosfodiestrową; Tr = -CPh 3

W 1950 roku, Har Gobind Khorana i współpracownicy opracowali fosfodiestrowe sposób, w którym 3'- O -acetylnucleoside-5'- O -fosforan 2 (schemat 3) aktywuje się N , N ' N'-dicykloheksylokarbodiimid (DCC) lub 4-toluenosulfonyl chlorek (Ts-Cl). Aktywowane indywidua poddano reakcji z 5'- O-zabezpieczonym nukleozydem 1, otrzymując zabezpieczony dinukleozydomonofosforan 3 . Po usunięciu grupy 3'- O- acetylowej za pomocą hydrolizy katalizowanej zasadą przeprowadzono dalsze wydłużanie łańcucha. Zgodnie z tą metodologią zsyntetyzowano zestawy tri- i tetradeoksyrybonukleotydów i enzymatycznie przekształcono je w dłuższe oligonukleotydy, co pozwoliło na wyjaśnienie kodu genetycznego . Główne ograniczenie metody fosfodiestrowej polegało na tworzeniu oligomerów pirofosforanowych i oligonukleotydów rozgałęzionych przy fosforanie międzynukleozydowym. Metoda wydaje się być krokiem wstecz od bardziej selektywnej chemii opisanej wcześniej; jednak w tamtym czasie większość dostępnych obecnie grup zabezpieczających fosforany nie została jeszcze wprowadzona. Brak dogodnej strategii ochrony wymagał wycofania się do wolniejszej i mniej selektywnej chemii, aby osiągnąć ostateczny cel badania.

Synteza fosforotriestrów

Schemat 4. Sprzęganie oligonukleotydów metodą fosfotriestrów; MMT = -CPh 2 (4-MeOC 6 H 4 ).

W latach 60. grupy kierowane przez R. Letsingera i C. Reese opracowały podejście fosfotriestrowe. Cechą różnica w stosunku do podejścia fosfodiestrowe była ochrona grupy fosforanowej w bloku budowlanego 1 (Schemat 4), a w urządzeniu 3 z 2-cyjanoetylo grupy. To wykluczało tworzenie się oligonukleotydów rozgałęzionych na fosforanie międzynukleozydowym. Wyższa selektywność metody pozwoliła na zastosowanie wydajniejszych środków sprzęgających i katalizatorów, co radykalnie skróciło czas syntezy. Metoda, początkowo opracowana dla syntezy w fazie roztworu, została również wdrożona na polistyrenie o niskim usieciowaniu „popcorn”, a później na szkle o kontrolowanych porach (CPG, patrz „Materiał stałego nośnika” poniżej), co zapoczątkowało ogromny wysiłek badawczy w syntezie oligonukleotydów w fazie stałej i ostatecznie doprowadziło do automatyzacji składania łańcucha oligonukleotydów.

Synteza triestru fosforynowego

W latach 70. do tworzenia wiązań międzynukleozydowych z powodzeniem stosowano znacznie bardziej reaktywne pochodne nukleozydów P(III), 3' - O -chlorofosforyny. Doprowadziło to do odkrycia metodologii tristra fosforytów . Grupa prowadzona przez M. Caruthersa wykorzystała mniej agresywne i bardziej selektywne 1H- tetrazolidofosforyny i zastosowała metodę na fazie stałej. Niedługo potem pracownicy z tej samej grupy ulepszyli metodę, stosując jako elementy budulcowe bardziej stabilne amidofosforyny nukleozydów. Zastosowanie grupy zabezpieczającej fosforyn 2-cyjanoetylu zamiast mniej przyjaznej dla użytkownika grupy metylowej doprowadziło do powstania amidofosforynów nukleozydów obecnie stosowanych w syntezie oligonukleotydów (patrz bloki budulcowe amidofosforynów poniżej). Wiele późniejszych ulepszeń w produkcji bloków budulcowych, syntetyzatorów oligonukleotydów i protokołów syntetycznych uczyniło chemię amidofosforynów bardzo niezawodną i dogodną metodą z wyboru do wytwarzania syntetycznych oligonukleotydów.

Synteza metodą fosforoamidytową

Cegiełki

Fosforamidyty nukleozydowe

Główny artykuł: amidofosforyn nukleozydowy
Zabezpieczone amidofosforyny 2'-deoksynukleozydów.

Jak wspomniano powyżej, naturalnie występujące nukleotydy (nukleozydo-3'- lub 5'-fosforany) i ich analogi fosfodiestrowe są niewystarczająco reaktywne, aby umożliwić szybkie syntetyczne przygotowanie oligonukleotydów z dużą wydajnością. Selektywność i szybkość tworzenia wiązań międzynukleozydowych jest radykalnie poprawiona dzięki zastosowaniu 3'- O- ( N , N- diizopropylofosforydynowych) pochodnych nukleozydów (fosforanoamidyny nukleozydów), które służą jako elementy budulcowe w metodologii tristrów fosforynowych. Aby zapobiec niepożądanym reakcjom ubocznym, wszystkie inne grupy funkcyjne obecne w nukleozydach należy uczynić nieaktywnymi (zabezpieczonymi) przez przyłączenie grup zabezpieczających . Po zakończeniu składania łańcucha oligonukleotydowego, wszystkie grupy zabezpieczające są usuwane z wytworzeniem pożądanych oligonukleotydów. Poniżej krótko omówiono grupy zabezpieczające obecnie stosowane w dostępnych w handlu i najpopularniejszych blokach budulcowych nukleozydów amidofosforynowych:

  • Grupa 5'-hydroksylowa jest chroniona przez kwaso-labilną grupę DMT (4,4'-dimetoksytritylową).
  • Tymina i uracyl , zasady nukleinowe odpowiednio tymidyny i urydyny , nie mają egzocyklicznych grup aminowych, a zatem nie wymagają żadnej ochrony.
  • Chociaż zasada nukleinowa guanozyny i 2'-deoksyguanozyny ma egzocykliczną grupę aminową, jej zasadowość jest niska do tego stopnia, że ​​nie reaguje z amidofosforynami w warunkach reakcji sprzęgania. Jednakże amidofosforyn pochodzący z N2-niezabezpieczonej 5'- 0 -DMT-2'-deoksyguanozyny jest słabo rozpuszczalny w acetonitrylu , rozpuszczalniku powszechnie stosowanym w syntezie oligonukleotydów. W przeciwieństwie do tego, wersje tego samego związku z zabezpieczeniem N2 dobrze rozpuszczają się w acetonitrylu i dlatego są szeroko stosowane. Zasady nukleinowe adenina i cytozyna zawierają egzocykliczne grupy aminowe reagujące z aktywowanymi amidofosforynami w warunkach reakcji sprzęgania. Przez zastosowanie dodatkowych etapów w cyklu syntezy lub alternatywnych środków sprzęgających i układów rozpuszczalników, łączenie łańcucha oligonukleotydowego można przeprowadzić przy użyciu amidofosforynów dA i dC z niezabezpieczonymi grupami aminowymi. Jednak podejścia te pozostają obecnie na etapie badań. W rutynowej syntezie oligonukleotydów egzocykliczne grupy aminowe w nukleozydach są trwale chronione na całej długości łańcucha oligonukleotydowego.

Ochrona egzocyklicznych grup aminowych musi być prostopadła do grupy 5'-hydroksylowej, ponieważ ta ostatnia jest usuwana na końcu każdego cyklu syntetycznego. Najprostszą do wdrożenia, a zatem najszerzej stosowaną strategią jest zainstalowanie nietrwałej zasadowo grupy zabezpieczającej na egzocyklicznych grupach aminowych. Najczęściej stosowane są dwa schematy ochrony.

  • W pierwszym, standardowym i bardziej rozbudowanym schemacie (rysunek), ochrona Bz (benzoilu) jest stosowana dla A, dA, C i dC, podczas gdy G i dG są chronione grupą izobutyrylową. Ostatnio grupa Ac (acetylowa) jest używana do ochrony C i dC, jak pokazano na rysunku.
  • W drugim, łagodnym schemacie ochrony, A i dA są chronione grupami izobutyrylowymi lub fenoksyacetylowymi (PAC). C DC Ochrona opatrzone acetyl i G i dG zabezpieczone są 4-isopropylphenoxyacetyl ( ı dimethylformamidino (DMF) grup PR-PAC) lub. Łagodne grupy zabezpieczające są usuwane łatwiej niż standardowe grupy zabezpieczające. Jednak fosforoamidyty zawierające te grupy są mniej stabilne, gdy są przechowywane w roztworze.
  • Grupa fosforynowa jest chroniona przez nietrwałą w zasadzie grupę 2-cyjanoetylową . Po sprzężeniu amidofosforynu ze stałym oligonukleotydem związanym z podłożem i przekształceniu ugrupowań fosforynowych w formy P(V), obecność ochrony fosforanowej nie jest konieczna do pomyślnego przeprowadzenia dalszych reakcji sprzęgania.
2'- O -zabezpieczone amidofosforyny rybonukleozydu.
  • W syntezie RNA, grupa 2'-hydroksylowa jest chroniona grupą TBDMS ( t -butylodimetylosililową). lub TOM (tri- izo -propylsilyloxymethyl) grupy, przy czym obie są usuwalne przez działanie jonu fluorkowego.
  • Fosforyn ugrupowanie posiada również diizopropyloamino ( ı Pr 2 N) grupy reaktywne w warunkach kwasowych. Po aktywacji, grupa diizopropyloaminowa pozostaje do zastąpienia przez grupę 5'-hydroksylową oligonukleotydu związanego z nośnikiem (patrz „Etap 2: Sprzęganie” poniżej).

Fosforamidyty nienukleozydowe

Fosforamidy nienukleozydowe do modyfikacji 5' syntetycznych oligonukleotydów. MMT = monometoksytrityl,(4-metoksyfenylo)difenylometyl.

Fosforamidyty nienukleozydowe to odczynniki amidofosforynowe przeznaczone do wprowadzania różnych funkcji funkcjonalnych na końcach syntetycznych oligonukleotydów lub między resztami nukleotydowymi w środku sekwencji. Aby modyfikator nienukleozydowy mógł zostać wprowadzony do sekwencji, musi posiadać co najmniej dwie grupy hydroksylowe, z których jedna jest często chroniona grupą DMT, podczas gdy druga zawiera reaktywne ugrupowanie amidofosforynowe.

Do wprowadzenia pożądanych grup, które nie są dostępne w naturalnych nukleozydach lub które można łatwiej wprowadzić przy użyciu prostszych projektów chemicznych, stosuje się nienukleozydowe amidofosforyny. Bardzo krótki wybór komercyjnych odczynników amidofosforynowych pokazano na schemacie w celu wykazania dostępnej różnorodności strukturalnej i funkcjonalnej. Odczynniki te służą do przyłączania grup fosforanowych na końcu 5' ( 1 ), NH 2 ( 2 ), SH ( 3 ), aldehydowych ( 4 ) i karboksylowych ( 5 ), wiązań potrójnych CC ( 6 ), znaczników nieradioaktywnych i tłumiących (przykładowo przez 6-FAM amidynu 7 do mocowania fluoresceiny i Dabcyl amidynu 8 , odpowiednio), hydrofilowych i modyfikatory hydrofobowe (na przykładzie glikolu heksaetylenowego amidynu 9 i cholesterolu amidynu 10 , odpowiednio), i biotyny amidynu 11 .

Cykl syntezy

Schemat 5. Cykl syntezy do otrzymywania oligonukleotydów metodą amidofosforynową.

Syntezę oligonukleotydów prowadzi się przez stopniowe dodawanie reszt nukleotydowych do 5'-końca rosnącego łańcucha, aż do złożenia żądanej sekwencji. Każdy dodatek nazywany jest cyklem syntezy (Schemat 5) i składa się z czterech reakcji chemicznych:

Krok 1: Odblokowanie (detritylacja)

Grupę DMT usuwa się roztworem kwasu, takiego jak 2% kwas trichlorooctowy (TCA) lub 3% kwas dichlorooctowy (DCA), w obojętnym rozpuszczalniku ( dichlorometan lub toluen ). Utworzony pomarańczowy kation DMT jest wypłukiwany; w wyniku tego etapu otrzymuje się związany ze stałym nośnikiem prekursor oligonukleotydowy niosący wolną 5'-końcową grupę hydroksylową. Warto pamiętać, że prowadzenie detritylacji przez dłuższy czas lub silniejszymi niż zalecane roztworami kwasów prowadzi do depurynacji oligonukleotydu związanego z podłożem stałym, a tym samym zmniejsza wydajność pożądanego produktu o pełnej długości.

Krok 2: Łączenie

0,02-0,2 M roztwór fosforamidytu nukleozydu (lub mieszanina kilku amidofosforynów) w acetonitrylu aktywuje się 0,2-0,7 M roztworem kwaśnego azolowej katalizatora 1 H -tetrazol , 5-etylotio-1 H-tetrazolu, 2-benzylthiotetrazole 4,5-dicyjano imidazolu lub szereg podobnych związków. Szersze informacje na temat zastosowania różnych środków sprzęgających w syntezie oligonukleotydów można znaleźć w niedawnym przeglądzie. Mieszanie jest zwykle bardzo krótkie i zachodzi w płynnych liniach syntezatorów oligonukleotydów (patrz niżej), podczas gdy składniki są dostarczane do reaktorów zawierających nośnik stały. Aktywowany amidofosforyn w 1,5 – 20-krotnym nadmiarze w stosunku do materiału związanego z nośnikiem kontaktuje się następnie z wyjściowym stałym nośnikiem (pierwsze sprzęganie) lub prekursorem oligonukleotydu związanego z nośnikiem (po sprzęganiu), którego grupa 5'-hydroksylowa reaguje z aktywowane ugrupowanie amidofosforynowe wchodzącego nukleozydu amidofosforynowego tworzące wiązanie triestrowe fosforynu. Sprzęganie amidofosforynów 2'-deoksynukleozydów jest bardzo szybkie i na małą skalę wymaga około 20 s do jego zakończenia. W przeciwieństwie do tego, amidofosforyny rybonukleozydowe z zawadą przestrzenną 2'- O -zabezpieczone wymagają 5-15 minut do sprzęgania z dużą wydajnością. Reakcja jest również bardzo wrażliwa na obecność wody, zwłaszcza gdy stosuje się rozcieńczone roztwory amidofosforynów i jest powszechnie prowadzona w bezwodnym acetonitrylu. Generalnie im większa skala syntezy, tym mniejszy nadmiar i wyższe stężenie fosforoamidytów. W przeciwieństwie do tego, stężenie aktywatora zależy przede wszystkim od jego rozpuszczalności w acetonitrylu i jest niezależne od skali syntezy. Po zakończeniu sprzęgania wszelkie niezwiązane odczynniki i produkty uboczne są usuwane przez płukanie.

Krok 3: Zamykanie

Etap zamykania przeprowadza się przez traktowanie stałego materiału związanego z nośnikiem mieszaniną bezwodnika octowego i 1-metyloimidazolu lub, rzadziej, DMAP jako katalizatorów i, w metodzie amidofosforynowej, służy dwóm celom.

  • Po zakończeniu reakcji sprzęgania niewielki procent grup 5'-OH związanych ze stałym podłożem (0,1 do 1%) pozostaje nieprzereagowany i musi być trwale zablokowany przed dalszym wydłużaniem łańcucha, aby zapobiec tworzeniu się oligonukleotydów z wewnętrzną zasadą skreślenie powszechnie określane jako (n-1) shortmery. Nieprzereagowane grupy 5'-hydroksylowe są w dużym stopniu acetylowane przez mieszaninę przykrywającą.
  • Stwierdzono również doniesienia, że fosforoamidyty aktywowany 1 H -tetrazol reakcji w niewielkim stopniu, z O 6 położenia guanozyny. Po utlenieniu I 2 / woda, produkt ten bok, ewentualnie za pomocą o 6 -N7 migracji ulega depurynacji . W apurynowy strony w ten sposób tworzą się łatwo rozpada się w trakcie ostatecznego odbezpieczania oligonukleotydem w warunkach zasadowych, (patrz poniżej) z uzyskaniem dwóch krótszych oligonukleotydów, zmniejszając w ten sposób wydajność produktu o pełnej długości. Do wyjść 6 modyfikacje są szybko usuwane poprzez traktowanie z reagentem pokrywającej dopóki etap przykrycie jest wykonywane przed utlenianiem z I 2 / woda.
  • Syntezę tiofosforanów oligonukleotydów (OPS patrz poniżej) nie obejmuje utleniania z I 2 / woda i, odpowiednio, nie cierpi z powodu reakcji ubocznych opisano powyżej. Z drugiej strony, jeśli etap zamykania przeprowadza się przed siarkowaniem, stały nośnik może zawierać resztkowy bezwodnik octowy i N-metyloimidazol pozostały po etapie zamykania. Mieszanina przykrywająca przeszkadza w reakcji przenoszenia siarki, co skutkuje rozległym tworzeniem wiązań międzynukleozydowych w postaci triestrów fosforanowych w miejsce pożądanychtriestrów PS. Dlatego do syntezy OPS wskazane jest przeprowadzenie etapu siarkowania przed etapem kapslowania.

Krok 4: Utlenianie

Nowo utworzone trójkoordynacyjne wiązanie triestrowe fosforynu nie jest naturalne i ma ograniczoną stabilność w warunkach syntezy oligonukleotydów. Traktowanie materiału związanego z nośnikiem za pomocą jodu i wody w obecności słabej zasady (pirydyny, lutydyny lub kolidyny ) powoduje utlenienie triplestru fosforynowego do tetrakoordynowanego triplestru fosforanowego, chronionego prekursora naturalnie występującego wiązania międzynukleozydowego diestru fosforanowego. Utlenianie można prowadzić w warunkach bezwodnych przy użyciu wodoronadtlenku tert-butylu lub, bardziej efektywnie, (1S)-(+)-(10-kamforosulfonylo)oksazyrydyny (CSO). Etap utleniania można zastąpić etapem siarkowania w celu uzyskania tiofosforanów oligonukleotydów (patrz tiofosforany oligonukleotydów i ich synteza poniżej). W tym ostatnim przypadku etap siarkowania najlepiej przeprowadzić przed zamknięciem.

Solidne podpory

W syntezie w fazie stałej, składany oligonukleotyd jest kowalencyjnie związany poprzez swoją 3'-końcową grupę hydroksylową ze stałym materiałem nośnika i pozostaje z nim związany przez cały przebieg składania łańcucha. Podłoże stałe zawarte jest w kolumnach, których wymiary zależą od skali syntezy i mogą wahać się od 0,05  ml do kilku litrów. Zdecydowana większość oligonukleotydów jest syntetyzowana na małą skalę w zakresie od 10 nmol do 1 μmol. Ostatnio wysokowydajna synteza oligonukleotydów, w której stały nośnik znajduje się w studzienkach płytek wielostudzienkowych (najczęściej 96 lub 384 studzienek na płytkę) stała się metodą z wyboru do równoległej syntezy oligonukleotydów na małą skalę. Na końcu układu łańcucha oligonukleotyd jest uwalniany ze stałego podłoża i jest eluowany z kolumny lub studzienki.

Solidny materiał podporowy

W przeciwieństwie do organicznej syntezy w fazie stałej i syntezy peptydów , synteza oligonukleotydów przebiega najlepiej na niepęczniejących lub słabo pęczniejących podłożach stałych. Dwa najczęściej używane materiały w fazie stałej to szkło o kontrolowanych porach (CPG) i makroporowaty polistyren (MPPS).

  • CPG jest powszechnie definiowany przez wielkość porów. W chemii oligonukleotydów stosuje się rozmiary porów 500, 1000, 1500, 2000 i 3000  Å, aby umożliwić przygotowanie odpowiednio około 50, 80, 100, 150 i 200-merowych oligonukleotydów. Aby natywny CPG nadawał się do dalszego przetwarzania, powierzchnię materiału traktuje się (3-aminopropylo)trietoksysilanem, otrzymując aminopropylo CPG. Ramię aminopropylowe można dalej przedłużyć, aby uzyskać długołańcuchowy aminoalkil (LCAA) CPG. Grupę aminową stosuje się następnie jako punkt kotwiczenia dla łączników odpowiednich do syntezy oligonukleotydów (patrz poniżej).
  • MPPS odpowiedni do syntezy oligonukleotydów jest nisko pęczniejącym, silnie usieciowanym polistyrenem otrzymywanym przez polimeryzację diwinylobenzenu (min 60%), styrenu i 4- chlorometylostyrenu w obecności środka porogennego. Otrzymany makroporowaty chlorometylowy MPPS jest przekształcany w aminometylowy MPPS.

Chemia linkera

Komercyjne nośniki stałe do syntezy oligonukleotydów.
Schemat 6. Mechanizm 3'-defosforylacji oligonukleotydów osadzonych na uniwersalnych podłożach stałych.

Aby materiał stałego nośnika był odpowiedni do syntezy oligonukleotydów, do reaktywnych grup aminowych w aminopropylo CPG, LCAA CPG lub aminometylo MPPS przyłącza się kowalencyjnie łączniki nienukleozydowe lub bursztyniany nukleozydu. Pozostałe nieprzereagowane grupy aminowe są zakończone bezwodnikiem octowym . Zazwyczaj stosuje się trzy koncepcyjnie różne grupy podpór stałych.

  • Podpory uniwersalne . W nowszym, wygodniejszym i szerzej stosowanym sposobie synteza rozpoczyna się od uniwersalnego nośnika, w którym do stałego materiału nośnika przyłączony jest nienukleozydowy łącznik (związki 1 i 2 ). Fosforamidyn odpowiadający 3'-końcowej reszcie nukleozydu jest sprzęgany z uniwersalnym stałym podłożem w pierwszym cyklu syntezy składania łańcucha oligonukleotydów przy użyciu standardowych protokołów. Składanie łańcucha jest następnie kontynuowane aż do zakończenia, po czym oligonukleotyd związany ze stałym podłożem jest odbezpieczany. Charakterystyczną cechą uniwersalnych stałych nośników jest to, że uwalnianie oligonukleotydów następuje przez hydrolityczne rozszczepienie wiązania PO, które łączy 3'- O 3'-końcowej reszty nukleotydowej z uniwersalnym łącznikiem, jak pokazano na Schemacie 6. krytyczną zaletą tego podejścia jest to, że stosuje się ten sam stały nośnik niezależnie od sekwencji syntetyzowanego oligonukleotydu. W celu całkowitego usunięcia łącznika i 3'-końcowego fosforanu z złożonego oligonukleotydu, stały nośnik 1 i kilka podobnych stałych nośników wymaga gazowego amoniaku, wodnego roztworu wodorotlenku amonu, wodnego roztworu metyloaminy lub ich mieszaniny i są one dostępne w handlu. Stały nośnik 2 wymaga roztworu amoniaku w bezwodnym metanolu i jest również dostępny w handlu.
  • Nukleozydowe nośniki stałe . W historycznie pierwszym i wciąż popularnym podejściu, grupa 3'-hydroksylowa 3'-końcowej reszty nukleozydu jest przyłączona do stałego nośnika poprzez, najczęściej, ramię 3'- O- sukcynylowe, jak w związku 3 . Złożenie łańcucha oligonukleotydowego zaczyna się od sprzężenia bloku budulcowego amidofosforynu odpowiadającego reszcie nukleotydowej drugiej od końca 3'. 3'-końcową grupę hydroksylową w oligonukleotydach syntetyzowanych na nukleozydowych stałych nośnikach odbezpiecza się w warunkach nieco łagodniejszych niż te stosowane dla uniwersalnych stałych nośników. Jednak fakt, że stały nośnik nukleozydowy musi być wybrany w sposób specyficzny dla sekwencji, zmniejsza przepustowość całego procesu syntezy i zwiększa prawdopodobieństwo błędu ludzkiego.
  • Do przyłączenia żądanych grup funkcyjnych lub reporterowych na 3'-końcu syntetycznych oligonukleotydów stosuje się specjalne stałe nośniki . Na przykład, dostępny w handlu nośnik stały 4 umożliwia przygotowanie oligonukleotydów zawierających 3'-końcowy łącznik 3-aminopropylowy. Podobnie jak w nienukleozydowe fosforoamidyty, wiele innych specjalnych stałe nośniki przeznaczone do mocowania reaktywnych grup funkcyjnych, nieradioaktywne grup reporterowych i modyfikatory końcowych ( EC cholesterol lub inne blokery hydrofobowe) i nadaje się do różnych zastosowań są dostępne w handlu. Bardziej szczegółowe informacje na temat różnych stałych nośników do syntezy oligonukleotydów można znaleźć w niedawnym przeglądzie.

Fosforotioniany oligonukleotydów i ich synteza

S P R s -diastereomeric wewnątrznukleozydowe wiązania fosforotionianowe.

Fosforotioniany oligonukleotydów (OPS) to zmodyfikowane oligonukleotydy, w których jeden z atomów tlenu w ugrupowaniu fosforanowym jest zastąpiony siarką. Jedynie fosforotioniany zawierające siarkę w pozycji niemostkującej, jak pokazano na figurze, są szeroko stosowane i dostępne w handlu. Zastąpienie niemostkującego tlenu siarką tworzy nowe centrum chiralności przy fosforze . W prostym przypadku dinukleotyd Prowadzi to do tworzenia się diastereomerycznego pary S p - i R s -dinucleoside monophosphorothioates których struktury są przedstawione na rysunku. W n- merowym oligonukleotydzie, w którym wszystkie ( n  – 1) wiązania międzynukleozydowe są wiązaniami tiofosforanowymi, liczbę diastereoizomerów m oblicza się jako m = 2 ( n  – 1) . Będąc nienaturalnymi analogami kwasów nukleinowych, OPS są znacznie bardziej odporne na hydrolizę przez nukleazy , klasę enzymów, które niszczą kwasy nukleinowe przez rozerwanie mostkowego wiązania PO ugrupowania fosfodiestrowego. Ta właściwość determinuje zastosowanie OPS jako antysensownych oligonukleotydów w zastosowaniach in vitro i in vivo , gdzie nieunikniona jest ekstensywna ekspozycja na nukleazy. Podobnie, aby poprawić stabilność siRNA , na końcu 3' zarówno nici sensownej, jak i antysensownej wprowadza się często co najmniej jedno wiązanie tiofosforanowe . W chiralnie czystym OPS diastereoizomery all-Sp są bardziej odporne na degradację enzymatyczną niż ich analogi all-Rp. Jednak przygotowanie chiralnie czystego OPS pozostaje wyzwaniem syntetycznym. W praktyce laboratoryjnej powszechnie stosuje się mieszaniny diastereoizomerów OPS.

Synteza OPS jest bardzo podobna do syntezy naturalnych oligonukleotydów. Różnica polega na tym, że etap utleniania jest zastępowany reakcją przenoszenia siarki (siarczenie) i że etap zamykania przeprowadza się po siarkowaniu. Spośród wielu zgłoszonych odczynników zdolnych do wydajnego przenoszenia siarki tylko trzy są dostępne na rynku:

Handlowe środki przenoszenia siarki do syntezy oligonukleotydów.
  • 3-(dimetyloaminometylideno)amino-3H-1,2,4-ditiazolo-3-tion, DDTT ( 3 ) zapewnia szybką kinetykę siarkowania i wysoką stabilność w roztworze. Odczynnik jest dostępny z kilku źródeł.
  • 3 H 1,2-benzoditiol-3-on 1,1-ditlenek ( 4 ), znany również jako Beaucage wyświetlaczy odczynników lepszą rozpuszczalność w acetonitrylu i krótki czas reakcji. Jednak odczynnik ma ograniczoną stabilność w roztworze i jest mniej skuteczny w siarkowaniu wiązań RNA.
  • Disiarczek N,N, N'N'-tetraetylotiuramu (TETD) jest rozpuszczalny w acetonitrylu i jest dostępny w handlu. Jednak reakcja siarkowania międzynukleozydowego wiązania DNA z TETD wymaga 15 minut, czyli ponad 10 razy wolniej niż w przypadku związków 3 i 4 .

Automatyzacja

W przeszłości syntezę oligonukleotydów przeprowadzano ręcznie w roztworze lub na fazie stałej. Do syntezy fazy stałej wykorzystano, jako zbiorniki fazy stałej, miniaturowe szklane kolumny zbliżone kształtem do niskociśnieniowych kolumn chromatograficznych lub strzykawek wyposażonych w filtry porowate. Obecnie synteza oligonukleotydów w fazie stałej odbywa się automatycznie przy użyciu instrumentów sterowanych komputerowo (syntetyzatory oligonukleotydów) i jest technicznie realizowana w formacie kolumnowym, wielodołkowym i macierzowym. Format kolumny najlepiej nadaje się do badań i zastosowań na dużą skalę, gdzie nie jest wymagana wysoka przepustowość. Format płytki wielodołkowej został zaprojektowany specjalnie do wysokowydajnej syntezy na małą skalę, aby zaspokoić rosnące zapotrzebowanie przemysłu i środowiska akademickiego na syntetyczne oligonukleotydy. W handlu dostępnych jest wiele syntetyzatorów oligonukleotydów do syntezy na małą skalę oraz do syntezy na średnią i dużą skalę.

Pierwsze komercyjnie dostępne syntezatory oligonukleotydów

W marcu 1982 r. odbył się kurs praktyczny na Wydziale Biochemii Technische Hochschule Darmstadt w Niemczech. Uczestniczyli m.in. MH Caruthers, MJ Gait, HG Gassen, H.Koster, K. Itakura i C. Birr. Program obejmował zajęcia praktyczne, wykłady i seminaria na temat syntezy chemicznej oligonukleotydów w fazie stałej. Wyselekcjonowana grupa 15 uczniów wzięła udział i miała niespotykaną dotąd możliwość bycia instruowanym przez szacowną kadrę pedagogiczną.

PosterAutomationConference.jpg

Oprócz ćwiczeń manualnych w kursie wzięło udział kilka znanych firm automatyzacyjnych. Biosearch Novato, CA, Genetic Design of Watertown, MA, to dwie z kilku firm, które zademonstrowały na kursie zautomatyzowane syntezatory. Biosearch zaprezentował swój nowy syntezator SAM I. Genetic Design opracowało swój syntezator na podstawie projektu sekwencera peptydów w fazie stałej (Sequemat). Genetic Design zaaranżował z dr Christianem Birrem (Max-Planck-Institute for Medical Research) [1] na tydzień przed wydarzeniem, aby przekształcić jego sekwencer fazy stałej w półautomatyczny syntezator. Zespół kierowany przez dr Alexa Bonnera i Ricka Nevesa przekształcił urządzenie i przetransportował je do Darmstadt na imprezę i zainstalował w laboratorium biochemicznym w Technische Hochschule. Ponieważ system był półautomatyczny, użytkownik w każdym cyklu wstrzykiwał następną bazę, która miała być dodana do sekwencji wzrostu. System działał dobrze i wyprodukował serię probówek wypełnionych jasnoczerwonym kolorem tritylowym wskazującym na całkowite sprzężenie na każdym etapie. System ten został później w pełni zautomatyzowany przez włączenie automatycznego wtryskiwacza i został oznaczony jako Model 25A.

Historia syntezy oligonukleotydów na średnią i dużą skalę

Syntetyzatory oligonukleotydów na dużą skalę były często opracowywane przez rozszerzanie możliwości istniejącej platformy instrumentów. Jeden z pierwszych syntezatorów średniej skali pojawił się pod koniec lat 80. XX wieku, wyprodukowany przez firmę Biosearch w Novato w Kalifornii (8800). Platforma ta została pierwotnie zaprojektowana jako syntezator peptydów i wykorzystywała reaktor ze złożem fluidalnym niezbędny do dostosowania charakterystyki pęcznienia nośników polistyrenowych stosowanych w metodologii Merrifield. Synteza oligonukleotydów obejmowała zastosowanie CPG (szkła o kontrolowanych porach), które jest sztywnym podłożem i jest bardziej odpowiednie dla reaktorów kolumnowych, jak opisano powyżej. Skala 8800 była ograniczona do natężenia przepływu wymaganego do fluidyzacji podpory. Niektóre nowatorskie konstrukcje reaktorów, a także ciśnienia wyższe niż normalne, umożliwiły 8800 osiągnięcie skali, która umożliwiłaby przygotowanie 1 mmola oligonukleotydu. W połowie lat 90-tych kilka firm opracowało platformy oparte na półpreparatywnych i preparatywnych chromatografach cieczowych. Systemy te były dobrze dopasowane do podejścia opartego na reaktorze kolumnowym. W większości przypadków wystarczyło tylko zwiększyć liczbę płynów, które można było dostarczyć do kolumny. Synteza oligo wymaga co najmniej 10, a chromatografy cieczowe zwykle mieszczą 4. Było to łatwe zadanie projektowe, a niektóre strategie półautomatyczne działały bez żadnych modyfikacji istniejącego wcześniej sprzętu LC. PerSeptive Biosystems oraz Pharmacia (GE) to dwie z kilku firm, które opracowały syntezatory z chromatografów cieczowych. Genomic Technologies, Inc. była jedną z niewielu firm, które opracowały syntezator oligonukleotydów na dużą skalę, który był od podstaw syntezatorem oligonukleotydów. Początkowa platforma o nazwie VLSS dla bardzo dużej skali syntezatora wykorzystywała duże kolumny do chromatografii cieczowej Pharmacia jako reaktory i mogła zsyntetyzować do 75 milimoli materiału. Wiele fabryk syntezy oligonukleotydów zaprojektowało i wyprodukowało własne niestandardowe platformy i niewiele wiadomo, ponieważ projekty są zastrzeżone. Projekt VLSS był nadal udoskonalany i jest kontynuowany w syntezatorze QMaster, który jest zmniejszoną platformą zapewniającą miligramy do gramów syntetycznego oligonukleotydu.

Aktualne praktyki syntezy chemicznie modyfikowanych oligonukleotydów na dużą skalę zostały niedawno poddane przeglądowi.

Synteza mikromacierzy oligonukleotydowych

Główny artykuł: mikromacierz DNA § Wytwarzanie

Można wizualizować mikromacierz oligonukleotydów jako miniaturową płytkę wielodołkową, w której fizyczne przegrody między dołkami (plastikowe ścianki) są celowo usuwane. Pod względem chemicznym synteza mikromacierzy oligonukleotydowych różni się od konwencjonalnej syntezy oligonukleotydów pod dwoma względami:

5'- O -MeNPOC-zabezpieczony amidofosforyn nukleozydu.
  • Oligonukleotydy pozostają trwale związane z fazą stałą, co wymaga zastosowania łączników, które są stabilne w warunkach procedury ostatecznego odbezpieczenia.
  • Brak fizycznych przegród pomiędzy miejscami zajmowanymi przez poszczególne oligonukleotydy, bardzo ograniczona przestrzeń na powierzchni mikromacierzy (jedna sekwencja oligonukleotydowa zajmuje kwadrat 25×25 µm) oraz wymóg wysokiej wierności syntezy oligonukleotydów dyktują zastosowanie miejsca- selektywne techniki 5'-odbezpieczania. W jednym podejściu usunięcie grupy 5'- O- DMT odbywa się przez elektrochemiczne generowanie kwasu w wymaganym miejscu (miejscach). Inne podejście wykorzystuje grupę zabezpieczającą 5'- 0- (α-metylo-6-nitropiperonyloksykarbonyl) (MeNPOC), którą można usunąć przez napromieniowanie światłem UV o długości fali 365 nm.

Obróbka postsyntetyczna

Po zakończeniu składania łańcucha, związany ze stałym nośnikiem oligonukleotyd jest w pełni chroniony:

  • 5'-końcowa grupa 5'-hydroksylowa jest zabezpieczona grupą DMT;
  • Międzynukleozydowe ugrupowania fosforanowe lub tiofosforanowe są zabezpieczone grupami 2-cyjanoetylowymi;
  • Egzocykliczne grupy aminowe we wszystkich zasadach nukleinowych z wyjątkiem T i U są zabezpieczone acylowymi grupami zabezpieczającymi.

Aby dostarczyć funkcjonalny oligonukleotyd, wszystkie grupy zabezpieczające muszą zostać usunięte. Zabezpieczenie zasady N-acylowej i zabezpieczenie fosforanem 2-cyjanoetylu może być i jest często usuwane jednocześnie przez traktowanie zasadami nieorganicznymi lub aminami. Jednakże możliwość zastosowania tej metody jest ograniczona przez fakt, że rozszczepienie zabezpieczenia fosforanem 2-cyjanoetylu prowadzi do powstania akrylonitrylu jako produktu ubocznego. W silnie zasadowych warunkach wymaganych do usunięcia ochrony N-acylowej, akrylonitryl jest zdolny do alkilowania zasad nukleinowych, głównie w pozycji N3 reszt tyminy i uracylu, z wytworzeniem odpowiednich adduktów N3-(2-cyjanoetylo) przez Michaela reakcja . Powstawaniu tych produktów ubocznych można uniknąć traktując związane ze stałym podłożem oligonukleotydy roztworami zasad w rozpuszczalniku organicznym, na przykład 50% trietyloaminą w acetonitrylu lub 10% dietyloaminą w acetonitrylu. Ta obróbka jest zdecydowanie zalecana dla preparatów na średnią i dużą skalę i jest opcjonalna dla syntez na małą skalę, gdzie stężenie akrylonitrylu wytwarzanego w mieszaninie do odbezpieczania jest niskie.

Niezależnie od tego, czy najpierw usunięto grupy zabezpieczające fosforany, oligonukleotydy związane ze stałym podłożem odbezpiecza się przy użyciu jednego z dwóch ogólnych podejść.

  • (1) Najczęściej grupa 5'-DMT jest usuwana na końcu łańcucha oligonukleotydowego. Oligonukleotydy są następnie uwalniane z fazy stałej i odbezpieczane (zasada i fosforan) przez traktowanie wodnym roztworem wodorotlenku amonu , wodną metyloaminą , ich mieszaninami, gazowym amoniakiem lub metyloaminą lub, rzadziej, roztworami innych pierwszorzędowych amin lub zasad w temperaturze otoczenia lub podwyższonej . Usuwa to wszystkie pozostałe grupy zabezpieczające z 2'-deoksyoligonukleotydów, dając w wyniku mieszaninę reakcyjną zawierającą pożądany produkt. Jeśli oligonukleotyd zawiera jakiekolwiek 2'- 0 - zabezpieczone reszty rybonukleotydowe, protokół odbezpieczenia obejmuje drugi etap, w którym grupy sililowe zabezpieczające 2'- 0 -zabezpieczone są usuwane przez działanie jonem fluorkowym różnymi metodami. Całkowicie odbezpieczony produkt stosuje się w takim stanie, w jakim jest, lub pożądany oligonukleotyd można oczyścić wieloma sposobami. Najczęściej surowy produkt odsala się stosując wytrącanie etanolem , chromatografię wykluczania rozmiarów lub HPLC z odwróconą fazą . W celu wyeliminowania niepożądanych produktów obcinania, oligonukleotydy mogą być oczyszczane za pomocą poliakrylamidowym elektroforezy żelowej lub anionowymiennej HPLC, a następnie odsalaniu.
  • (2) Drugie podejście stosuje się tylko wtedy, gdy zamierzoną metodą oczyszczania jest HPLC z odwróconymi fazami . W tym przypadku 5'-końcowa grupa DMT, która służy jako hydrofobowy uchwyt do oczyszczania, jest utrzymywana na końcu syntezy. Oligonukleotyd odbezpiecza się w warunkach zasadowych, jak opisano powyżej, a po odparowaniu oczyszcza metodą HPLC w odwróconym układzie faz. Zebrany materiał jest następnie detritylowany w wodno-kwaśnych warunkach. Na małą skalę (mniej niż 0,01-0,02 mmol) często stosuje się traktowanie 80% wodnym roztworem kwasu octowego przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odparowanie mieszaniny reakcyjnej do sucha pod próżnią . Na koniec produkt jest odsalany, jak opisano powyżej.
  • W przypadku niektórych zastosowań do oligonukleotydu można przyłączyć dodatkowe grupy reporterowe przy użyciu różnych procedur postsyntetycznych.

Charakteryzacja

Rozprostowana ES MS surowego oligonukleotydu 5'-DMT-T 20 (masa obliczona 6324,26 Da).

Jak w przypadku każdego innego związku organicznego, rozsądnie jest scharakteryzować syntetyczne oligonukleotydy po ich przygotowaniu. W bardziej złożonych przypadkach (badania i syntezy na dużą skalę) oligonukleotydy są charakteryzowane po ich odbezpieczeniu i oczyszczeniu. Chociaż ostatecznym podejściem do charakteryzacji jest sekwencjonowanie , stosunkowo niedroga i rutynowa procedura, względy redukcji kosztów wykluczają jej zastosowanie w rutynowej produkcji oligonukleotydów. W codziennej praktyce wystarczy uzyskać masę cząsteczkową oligonukleotydu rejestrując jego widmo masowe . Obecnie do charakteryzowania oligonukleotydów szeroko stosowane są dwie metody: spektrometria masowa z elektrorozpylaniem (ES MS) i spektrometria masowa z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą czasu przelotu ( MALDI-TOF ). Aby otrzymać widma informacyjne, bardzo ważne jest, aby przed poddaniem próbki do analizy wymienić wszystkie jony metali, które mogą być obecne w próbce, na jony amonowe lub trialkiloamoniowe [ ec trietyloamoniowe, (C 2 H 5 ) 3 NH + ], albo metod.

  • W widmie ES MS dany oligonukleotyd generuje zestaw jonów, które odpowiadają różnym stanom jonizacji związku. Zatem oligonukleotyd o masie cząsteczkowej M generuje jony o masach (M – n H)/ n gdzie M to masa cząsteczkowa oligonukleotydu w postaci wolnego kwasu (wszystkie ładunki ujemne międzynukleozydowych grup fosfodiestrowych są neutralizowane H + ) , n to stan jonizacji, a H to masa atomowa wodoru (1 Da ). Najbardziej przydatny do charakteryzacji są jonami o n w zakresie od 2 do 5. Software dostarczonego z ostatnio wytworzonych instrumentów jest w stanie przeprowadzić dekonwolucji procedurę, która znajduje ona piki jonów, które należą do tego samego zestawu, i osiąga masę cząsteczkową od oligonukleotyd.
  • Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat profilu zanieczyszczeń oligonukleotydów, stosuje się chromatografię cieczową-spektrometrię mas (LC-MS lub HPLC-MS) lub spektrometrię mas z elektroforezą kapilarną (CEMS).

Zobacz też

Bibliografia

Dalsza lektura