Ureaza - Urease

Urease 2KAU.png
Model 3D ureazy z Klebsiella aerogenes , dwa jony Ni 2+ - pokazano jako zielone sfery.
Identyfikatory
Nr WE 3.5.1.5
Nr CAS 9002-13-5
Bazy danych
IntEnz Widok IntEnz
BRENDA Wpis BRENDY
ExPASy Widok NiceZyme
KEGG Wpis KEGG
MetaCyc szlak metaboliczny
PRIAM profil
Struktury WPB RCSB PDB PDBe Suma PDB
Ontologia genów AmiGO / QuickGO

Ureazy ( EC 3.5.1.5 ), funkcjonalnie, należą do nadrodziny z amidohydrolazy i phosphotriesterases. Ureazy znajdują się w licznych bakteriach , grzybach , algach , roślinach i niektórych bezkręgowcach , a także w glebie jako enzym glebowy . Są to metaloenzymy zawierające nikiel o dużej masie cząsteczkowej.

Te enzymy katalizują się hydrolizie z mocznika do dwutlenku węgla i amoniaku :

(NH 2 ) 2 CO + H 2 Oureaza→CO 2 + 2NH 3

Hydroliza mocznika przebiega dwuetapowo. W pierwszym etapie powstaje amoniak i karbaminian . Karbaminian spontanicznie i szybko ulega hydrolizie do amoniaku i kwasu węglowego . Aktywność ureazy zwiększa pH otoczenia, ponieważ wytwarzany jest amoniak, który jest zasadą.

Historia

Jego aktywność została po raz pierwszy zidentyfikowana w 1876 roku przez Frédérica Alphonse Musculus jako rozpuszczalny ferment. W 1926 r. James B. Sumner wykazał, że ureaza jest białkiem , badając jego postać krystaliczną. Praca Sumnera była pierwszą demonstracją, że białko może funkcjonować jako enzym i ostatecznie doprowadziła do uznania, że ​​większość enzymów to w rzeczywistości białka. Ureaza była pierwszym wykrystalizowanym enzymem. Za tę pracę Sumner otrzymał nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1946 roku. Strukturę krystaliczną ureazy po raz pierwszy rozwiązał PA Karplus w 1995 roku.

Struktura

Badanie z 1984 roku, skupiające się na ureazie z fasoli szparagowej wykazało, że centrum aktywne zawiera parę centrów niklu . Aktywację in vitro osiągnięto również za pomocą manganu i kobaltu zamiast niklu. Sole ołowiu działają hamująco .

Masa cząsteczkowa wynosi albo 480 kDa albo 545 kDa dla ureazy jack-bean (masa obliczona z sekwencji aminokwasowej). 840 aminokwasów na cząsteczkę, z czego 90 to reszty cysteiny.

Optymalne pH to 7,4 a optymalna temperatura to 60 °C. Substraty obejmują mocznik i hydroksymocznik .

Ureazy bakteryjne składają się z trzech odrębnych podjednostek, jednej dużej (α 60–76 kDa) i dwóch małych (β 8–21 kDa, γ 6–14 kDa) powszechnie tworzących (αβγ)3 trimery o stechiometrii o podwójnej symetrycznej strukturze (uwaga że powyższy obraz przedstawia strukturę jednostki asymetrycznej, jednej trzeciej prawdziwego zespołu biologicznego), są to enzymy bogate w cysteinę, co daje masę molową enzymu między 190 a 300 kDa.

Wyjątkową ureazę uzyskuje się z Helicobacter sp.. Składają się one z dwóch podjednostek α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa). Te podjednostki tworzą supramolekularny kompleks dodekamerowy . powtarzających się podjednostek α-β, każda sprzężona para podjednostek ma miejsce aktywne, łącznie 12 miejsc aktywnych. ( ). Odgrywa zasadniczą funkcję dla przetrwania, neutralizując kwas żołądkowy, umożliwiając wejście mocznika do peryplazmy przez kanał mocznikowy bramkowany protonami . W diagnostyce gatunków Helicobacter wykorzystuje się obecność ureazy .

Wszystkie ureazy bakteryjne są wyłącznie cytoplazmatyczne, z wyjątkiem tych z Helicobacter pylori , które wraz ze swoją aktywnością cytoplazmatyczną wykazują aktywność zewnętrzną wobec komórek gospodarza. Natomiast wszystkie ureazy roślinne są cytoplazmatyczne.

Ureazy grzybowe i roślinne składają się z identycznych podjednostek (~90 kDa każda), najczęściej łączonych jako trimery i heksamery. Na przykład ureaza fasoli ma dwie podjednostki strukturalne i jedną katalityczną. Podjednostka α zawiera miejsce aktywne, składa się z 840 aminokwasów w cząsteczce (90 cystein), jej masa cząsteczkowa bez jonów Ni(II) wynosi 90,77 kDa. Masa heksameru z 12 jonami niklu wynosi 545,34 kDa. Jest strukturalnie spokrewniony z trimerem (αβγ)3 bakteryjnych ureaz. Innymi przykładami struktur homoheksamerycznych ureaz roślinnych są enzymy soi, grochu gołębi i nasion bawełny.

Należy zauważyć, że chociaż składają się z różnych typów podjednostek, ureazy z różnych źródeł, od bakterii po rośliny i grzyby, wykazują wysoką homologię sekwencji aminokwasowych.

Czynność

K cat / K m ureazy w przetwarzania mocznika wynosi 10 14 razy większa niż prędkość w katalizowanej reakcji eliminacji mocznika . Istnieje wiele przyczyn tej obserwacji w przyrodzie. Bliskość mocznika do grup aktywnych w miejscu aktywnym wraz z prawidłową orientacją mocznika umożliwia szybkie zachodzenie hydrolizy . Sam mocznik jest bardzo stabilny ze względu na formy rezonansowe, które może przyjąć. Przyjmuje się, że stabilność mocznika wynika z jego energii rezonansowej , którą oszacowano na 30–40 kcal/mol. Dzieje się tak, ponieważ rezonans obojnaczy tworzy wszystkie elektrony oddające do węgla karbonylowego, co czyni go mniej elektrofilowym, co czyni go mniej reaktywnym na atak nukleofilowy.

Aktywna strona

Miejsce aktywne ureaz znajduje się w podjednostkach α (alfa) . Jest to centrum niklu bis-μ-hydroksodimerycznego o odległości międzyatomowej ~3,5 Å. > Para Ni(II) jest słabo sprzężona antyferromagnetycznie . Badania rentgenowskiej spektroskopii absorpcyjnej (XAS) Canavalia ensiformis (fasola zwyczajna ), Klebsiella aerogenes i Sporosarcina pasteurii (wcześniej znanej jako Bacillus pasteurii ) potwierdzają 5-6 koordynacyjnych jonów niklu z wyłącznie ligacją O/N, w tym dwa ligandy imidazolowe na nikiel. Proponuje się, aby substrat mocznikowy wypierał aquo ligandy .

Cząsteczki wody znajdujące się w kierunku otwarcia miejsca aktywnego tworzą czworościenną klaster, który wypełnia miejsce wnęki poprzez wiązania wodorowe . Proponuje się, aby niektóre reszty aminokwasowe tworzyły ruchomą klapkę miejsca, która bramkuje substrat. Reszty cysteiny są powszechne w regionie klapowym enzymów, co do których stwierdzono, że nie są istotne w katalizie, chociaż biorą udział w odpowiednim pozycjonowaniu innych kluczowych reszt w miejscu aktywnym. W przypadku ureazy Sporosarcina pasteurii , płat został znaleziony w konformacji otwartej, podczas gdy konformacja zamknięta jest najwyraźniej potrzebna do reakcji.

W porównaniu, podjednostki a ureazy Helicobacter pylori i innych ureaz bakteryjnych są wyrównane z ureazami fasoli szparagowej.

Nie zaobserwowano wiązania mocznika z miejscem aktywnym ureazy.

Proponowane mechanizmy

Blakeley/Zerner

Blakely i Zerner zaproponowali jeden mechanizm katalizy tej reakcji przez ureazę. Rozpoczyna się nukleofilowym atakiem tlenu karbonylowego cząsteczki mocznika na 5-koordynacyjne Ni (Ni-1). Słabo skoordynowany ligand wodny jest wypierany na jego miejsce. Pojedyncza para elektronów z jednego z atomów azotu na cząsteczce mocznika tworzy podwójne wiązanie z centralnym węglem, a powstały NH 2 − skoordynowanego substratu oddziałuje z pobliską grupą naładowaną dodatnio. Blakeley i Zerner zaproponowali tę pobliską grupę jako jon karboksylowy , chociaż zdeprotonowane karboksylany są naładowane ujemnie.

Ligand wodorotlenkowy na sześciu współrzędnych Ni jest deprotonowany przez zasadę. Węgiel karbonylowy jest następnie atakowany przez tlen elektroujemny. Para elektronów z podwójnego wiązania azot-węgiel powraca do azotu i neutralizuje ładunek na nim, podczas gdy węgiel o 4 koordynatach przyjmuje pośrednią orientację czworościenną.

Rozpad tego związku pośredniego jest następnie wspomagany przez grupę sulfhydrylową cysteiny zlokalizowaną w pobliżu miejsca aktywnego. Wodór wiąże się z jednym z atomów azotu, zrywając wiązanie z węglem i uwalniając NH
3cząsteczka. Jednocześnie zostaje zerwane wiązanie między tlenem a 6-koordynacyjnym niklem. To pozostawia jon karbaminianowy skoordynowany z 5-koordynacyjnym Ni, który jest następnie wypierany przez cząsteczkę wody, regenerując enzym.

Wytworzony karbaminian następnie samorzutnie ulega degradacji z wytworzeniem kolejnego amoniaku i kwasu węglowego .

Hausinger/Karplus

Mechanizm zaproponowany przez Hausingera i Karplusa jest próbą zrewidowania niektórych problemów widocznych w ścieżce Blakely'ego i Zernera i skupia się na pozycjach łańcuchów bocznych tworzących kieszeń wiążącą mocznik. Na podstawie struktur krystalicznych ureazy K. aerogenes argumentowano, że ogólna zasada stosowana w mechanizmie Blakely'ego , His 320 , była zbyt daleko od wody związanej z Ni2, aby deprotonować w celu utworzenia atakującego ugrupowania wodorotlenowego. Ponadto nie zidentyfikowano ogólnego ligandu kwasowego wymaganego do protonowania azotu mocznikowego. Hausinger i Karplus sugerują schemat odwróconej protonacji, w którym protonowana forma ligandu His 320 odgrywa rolę ogólnego kwasu, a woda związana z Ni2 jest już w stanie zdeprotonowanym. Mechanizm podąża tą samą ścieżką, z pominięciem ogólnej zasady (ponieważ nie ma już takiej potrzeby), a His 320 przekazuje swój proton, aby utworzyć cząsteczkę amoniaku, która jest następnie uwalniana z enzymu. Podczas gdy większość His 320 ligandów i wody związanej, nie będzie w swoich aktywnych postaciach (deprotonowaniu deprotonowaniu i odpowiednio), wyliczono, że około 0,3% całkowitej enzymu ureazy będzie aktywny w danym czasie. Choć logicznie rzecz biorąc, sugerowałoby to, że enzym nie jest bardzo wydajny, w przeciwieństwie do ustalonej wiedzy, zastosowanie schematu odwróconej protonacji zapewnia korzyść w postaci zwiększonej reaktywności formy aktywnej, równoważąc wady. Umieszczenie liganda His 320 jako istotnego składnika mechanizmu uwzględnia również region płata ruchomego enzymu. Ponieważ ten ligand histydynowy jest częścią ruchomego płata, wiązanie substratu mocznikowego do katalizy zamyka ten płatek nad miejscem aktywnym, a dodanie wzoru wiązania wodorowego do mocznika z innych ligandów w kieszonce, świadczy o selektywności ureazy enzym dla mocznika.

Ciurli/Mangani

Mechanizm zaproponowany przez Ciurli i Mangani jest jednym z nowszych i obecnie akceptowanych poglądów na mechanizm ureazy i opiera się głównie na różnych rolach dwóch jonów niklu w centrum aktywnym. Jeden z nich wiąże i aktywuje mocznik, drugi jon niklu wiąże i aktywuje nukleofilową cząsteczkę wody. W odniesieniu do tej propozycji, mocznik wchodzi do wnęki miejsca aktywnego, gdy ruchoma „klapa” (umożliwiająca wejście mocznika do miejsca aktywnego) jest otwarta. Stabilność wiązania mocznika z miejscem aktywnym uzyskuje się poprzez sieć wiązań wodorowych , orientującą substrat we wnęce katalitycznej. Mocznik wiąże się z pięciokoordynacyjnym niklem (Ni1) z karbonylowym atomem tlenu . Zbliża się do sześciokoordynacyjnego niklu (Ni2) jedną z jego grup aminowych, a następnie łączy dwa centra niklu. Wiązanie karbonylowego atomu tlenu mocznika z Ni1 jest stabilizowane przez stan protonowania His α222 Nԑ. Dodatkowo zmiana konformacyjna klapki ruchomej ze stanu otwartego do zamkniętego powoduje przegrupowanie grupy karbonylowej Ala α222 w taki sposób, że jej atom tlenu wskazuje na Ni2. Ala α170 Ala α366 są teraz zorientowane w taki sposób, że ich grupy karbonylowe działać jako akceptory wiązania wodorowego w kierunku NH 2 grupy mocznika, dopomagając w ten sposób ich wiązanie z Ni2. Mocznik jest bardzo słaba chelatujący ligand, ze względu na niską zasady Lewisa postaci jego NH 2 grupach. Jednak także tleny grupy karbonylowe Ala α170 Ala α366 zwiększyć zasadowość NH 2 grupy i umożliwiają wiązanie się Ni2. Dlatego w tym proponowanym mechanizmie umiejscowienie mocznika w miejscu aktywnym jest indukowane przez cechy strukturalne reszt miejsca aktywnego, które są ustawione tak, aby działały jako donory wiązań wodorowych w pobliżu Ni1 i jako akceptory w pobliżu Ni2. Główną różnicą strukturalną między mechanizmem Ciurli/Mangani a pozostałymi dwoma jest to, że zawiera on azot , mocznik mostkujący tlen, który jest atakowany przez mostkujący wodorotlenek .

Działanie w patogenezie

Ureazy bakteryjne są często sposobem patogenezy wielu schorzeń. Są one związane z encefalopatią wątrobową / śpiączką wątrobową , kamieniami infekcyjnymi i owrzodzeniem trawiennym.

Kamienie infekcyjne

Kamienie moczowe wywołane infekcją są mieszaniną struwitu (MgNH 4 PO 4 •6H 2 O) i apatytu węglanowego [Ca 10 (PO 4 )6 • CO 3 ]. Te wielowartościowe jony są rozpuszczalne, ale stają się nierozpuszczalne, gdy amoniak jest wytwarzany z mikrobiologicznej ureazy podczas hydrolizy mocznika , ponieważ zwiększa to pH otaczającego środowiska z około 6,5 do 9. Wynikająca z tego alkalizacja powoduje krystalizację kamienia . U ludzi mikrobiologiczna ureaza Proteus mirabilis jest najczęstsza w kamieniu moczowym wywołanym infekcją.

Ureaza w encefalopatii wątrobowej / śpiączce wątrobowej

Badania wykazały, że Helicobacter pylori wraz z marskością wątroby powoduje encefalopatię wątrobową i śpiączkę wątrobową . Helicobacter pylori to mikrobiologiczne ureazy znajdujące się w żołądku. Jako ureazy hydrolizują mocznik do amoniaku i kwasu węglowego . Ponieważ bakterie są zlokalizowane w żołądku, wytwarzany amoniak jest łatwo wychwytywany przez układ krążenia ze światła żołądka . Skutkuje to podwyższonym poziomem amoniaku we krwi i jest określane jako hiperamonemia , eradykacja Heliobacter pylori wykazuje znaczny spadek poziomu amoniaku .

Ureaza w chorobach wrzodowych

Helicobacter pylori jest również przyczyną wrzodów trawiennych, objawiających się w 55-68% zgłoszonych przypadków. Zostało to potwierdzone przez zmniejszyła wrzód krwawienia i wrzód nawrotu po eradykacji patogenów . W żołądku dochodzi do wzrostu pH błony śluzowej w wyniku hydrolizy mocznika , co zapobiega przemieszczaniu się jonów wodorowych między gruczołami a światłem żołądka . Ponadto wysokie stężenia amoniaku wpływają na ścisłe połączenia międzykomórkowe zwiększając przepuszczalność, a także zaburzając błonę śluzową żołądka.

Występowanie i zastosowania w rolnictwie

Mocznik występuje naturalnie w środowisku, a także jest wprowadzany sztucznie, stanowiąc ponad połowę wszystkich syntetycznych nawozów azotowych stosowanych na świecie. Uważa się , że intensywne stosowanie mocznika sprzyja eutrofizacji , pomimo obserwacji, że mocznik jest szybko przekształcany przez ureazy drobnoustrojów, a zatem zwykle nie utrzymuje się. Aktywność ureazy w środowisku jest często mierzona jako wskaźnik zdrowia społeczności drobnoustrojów. Pod nieobecność roślin aktywność ureazy w glebie przypisuje się na ogół mikroorganizmom heterotroficznym, chociaż wykazano, że niektóre chemoautotroficzne bakterie utleniające amon są zdolne do wzrostu na moczniku jako jedynym źródle węgla, azotu i energii.

Hamowanie ureazy jest ważnym celem w rolnictwie, ponieważ szybki rozkład nawozów na bazie mocznika jest nieekonomiczny i szkodliwy dla środowiska. Dwoma takimi inhibitorami są fosforodiamidan fenylu i triamid kwasu N-(n-butylo)tiofosforowego .

Biomineralizacja

Promując powstawanie węglanu wapnia , ureazy są potencjalnie przydatne w procesach inspirowanych biomineralizacją . Warto zauważyć, że mikrobiologicznie indukowane tworzenie się węglanu wapnia można wykorzystać do wytwarzania biobetonu.

Jako test diagnostyczny

Główny artykuł: Szybki test ureazy

Wiele patogenów przewodu pokarmowego lub dróg moczowych wytwarza ureazę, co pozwala na jej wykrycie jako diagnostykę w celu wykrycia obecności patogenów.

Do patogenów ureazo-dodatnich należą:

Ekstrakcja

Po raz pierwszy wyizolowany w postaci kryształu w 1926 roku przez Sumnera przy użyciu solwatacji acetonem i wirowania. Nowoczesna biochemia zwiększyła zapotrzebowanie na ureazę. Mączka z fasoli , nasiona arbuza i nasiona grochu to sprawdzone źródła ureazy.

Zobacz też

Bibliografia

Linki zewnętrzne